(1.9)--蛋白质电泳的检测方法.ppt

蛋白质电泳的检测方法双向凝胶电泳中三种蛋白质检测方法的比较

蛋白质电泳的检测1.发展历史2.染料的选择3.DIGE技术

1.发展历史早期染色方法用染料和生物大分子结合形成有色的复合物是电泳后检测最常用的方法。选用染料通常应考虑以下要求1)必须与大分子结合以形成一个不溶性的,有色的,紧密的复合物,但不结合到凝胶中和支持膜上,以便从胶中除去,否则高背景会影响蛋白带的辨别和定量扫描。2)染料必须容易溶解在对大分子没有影响的溶剂中,以利于背景的脱色。3)选用高吸光系数的染料有利于提高定量测定的灵敏度4)选用能与大分子有专一性结合的染料,并在结合后能产生不同的颜色,可以提高检测的选择性。

早期用于蛋白染色最常用的染料是氨基黑10B(amidoblack10B)、萘黑12B200(naphthaleneblack12B200)、萘酚蓝黑6B(naphthol6B)、水牛黑(buffaloblack)、榜蓝黑SC或SX

(pantacylblueblackSCorSX)。氨基黑是一种含有两个SOH基团的酸性重氯化合物,所以能被结合到蛋白质的阴离子基团上。

考玛斯亮蓝染色在蛋白染色方法中,目前以考玛斯亮蓝染色最为常用。因为它既克服了氨基黑染色灵敏度不高和进行定量扫描的限制,又较银染色方法简便。考玛斯亮蓝染色首先是由Fazekas等在1963年用于醋酸纤维素膜电泳,并认为同样可用于纸电泳,琼脂电泳和淀粉凝胶电冰。1965年Meyer等将此方法用于聚丙烯酰胺擬胶电泳。检测灵敏度约为0.2~0.5微克。考玛斯亮蓝(coomassiebrilliantblue)R-250郎三苯基甲烷(triphenylmethane)。每个分子含有两个SOH基团,偏酸性,和氨基黑一样也是结合在蛋白质的碱性基团上。在一定pH时,这种染料-蛋白复合物被完全解聚。考玛斯亮蓝R-250与不同蛋白结合呈现基本相同的颜色,并且在比较宽的范围内(15-20微克),扫描峰的面积与蛋白量有线性关系。对一些蛋白,如a-尿素酶,线性范围甚至为1~55微克。考玛斯亮蓝又分为R-250、R-350、G-250等。R为红蓝色,G为蓝绿色。考玛斯亮蓝G-250即二甲花青亮蓝(XyleneCyanineBrilliantBlue),是一种甲基取代的三苯基甲烷。考玛斯亮蓝R-250和G-250的结构式如图。

4,2.4.3银染色1979年Switzer和Merril等首先在“Anal.Biochem”上介绍了比考玛斯亮蓝染色灵敏100倍的银染色方法,它可以检测小至0.38ng/mm2的牛血清白蛋白。这个方法接着在1980年由Oakley等习进一步发展以达到简化程序和低消耗的目的。有关这个方法的研究很多,可参见Dunn和MerrillLi的综述。Ohsawa等报道了一种改进的银染方法,可检测小至10-15g(femtograrns,毫微克,毫沙克,尘克)的蛋白。由于银染的灵敏度高,各大公司均生产银染试剂盒。银染的机制是将蛋白带上的硝酸银(银离子)还原成金属银,以使锒颗粒沉积在蛋白带上。用银染蛋白的吸光度对它们的浓度作图呈现不同的斜率,表明染色的程度是与蛋白中的一些特殊基团有关。研究还表明碱性和含硫氨基酸在银染中的重要性所以不含或只含很少眺氨酸疲基的蛋白质有时呈负染。目前对银染的详细机制还不是非常清楚。

2.染料的选择常用的染料：苏丹黑、考马斯亮蓝、硝酸银……

考马斯亮蓝G-250（CoomassiebrilliantblueG-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg/mL，最小可测2.5μg/mL蛋白质，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。考马斯亮蓝有G250和R250两种。其中考马斯亮蓝G250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，常用来作为蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。

考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程：该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污剂的浓度超过0．2%影响测定结果。如TritonX-100、SD