(2.10)--蛋白质电泳染色鉴定技术.ppt

自主实验设计开题报告——蛋白质电泳染色鉴定技术

目录CONTENTS01课题的立体依据02课题的研究内容、研究目标以及拟解决的关键问题03拟采取的研究方案及可行性分析

课题的立题依据PARTONE

课题的立题依据常用的蛋白质染色试剂分为以考马斯亮蓝为代表的有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。其中考马斯亮蓝染色法的应用较为广泛，现将其与其他的蛋白质染色方法（主要是银染法）作一比较，帮助大家更好地去选择合适的蛋白质染色方法。蛋白质的染色常用的有4类：有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。其中有机试剂染色以考马斯亮蓝染色法（Coomassiebrilliantblue，CBB）为代表，在蛋白质分析中常用，但对低丰度蛋白质的显现较差;银染灵敏度虽高，却常与质谱不兼容;荧光染色以SYPRO试剂为主，蛋白质检测灵敏度高，能兼容质谱，但由于需要配备特殊的检测仪器及试剂的昂贵，未被作为常规方法使用;而同位素显色则存在安全性和操作局限性等问题。因此，筛选简便、节约、检测灵敏度高、质谱兼容的蛋白质着色法是蛋白质组研究所需。

课题的研究内容、研究目标以及拟解决的关键问题PARTTWO

研究内容对比五种蛋白质电泳染色鉴定技术，即四种操作方法不同的考马斯亮蓝染色法（用G250）和银染法进行对比。

研究目标对比五种蛋白质电泳染色鉴定技术，即四种操作方法不同的考马斯亮蓝染色法（用G250）和银染法进行对比并且寻找更适合的蛋白质染色方法。

拟解决的关键问题根据条带的显色水平比较不同染色方法的检测灵敏性。

拟采取的研究方案及可行性分析PARTTHREE

拟采取的研究方案请在此添加文字说明，请在此添加文字说明，请在此添加文字说明，请在此添加文字说明，请在此添加文字说明，请在此添加文字说明实验原理：染色方法对比考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比。与蛋白质的结合反应十分迅速，常用来作为蛋白质含量的测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg/mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。考马斯亮蓝R250与蛋白质结合虽然比较缓慢,但是染料可以穿透凝胶,染胶效果好,染色后为红蓝色可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。银染：银染是检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质，是银离子在碱性pH环境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质的表面上显色的原理。银染的方法种类很多，目前有文献报道的就有100多种。但是其准确的染色机制还不是特别地清楚。大致的原理是银离子在碱性pH环境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质的表面上而显色。由于银染的灵敏度很高，可染出胶上低于1ng/蛋白质点，故广泛的用在2D凝胶分析上，及极低蛋白含量测定的垂直凝胶中。

拟采取的研究方案请在此添加文字说明，请在此添加文字说明，请在此添加文字说明，请在此添加文字说明，请在此添加文字说明，请在此添加文字说明实验原理：蛋白质检测灵敏度的影响因素:蛋白质着色显示的灵敏性既取决于染色试剂，又与染色过程中涉及的有机溶剂及离子有关。在考马斯亮蓝染色法和银染法中都存在如甲醇、乙醇、乙酸、甲醛等有机溶剂的使用。甲醇和乙醇在染色里起固定作用，把蛋白质固定在凝胶中或阻滞它们在凝胶中扩散。同时也去除电泳过程中的干扰染色过程的物质，如去垢剂、还原剂和缓冲液等成分。乙酸的作用既是辅助固定蛋白质同时又维持染液的酸性度，以利于考马斯亮蓝与蛋白质结合。他们的存在有利于获得背景清晰、信噪比高的图像。由于3种有机溶剂的相似作用，我们在胶体考马斯亮蓝染色法及改良考马斯亮蓝染色法里，保留乙醇作为最初的固定清洁剂，用磷酸替代乙酸发挥酸化作用。在胶体考马斯亮蓝染色法中，酸性的乙醇介质中加入硫酸铵，使得着色剂形成胶体染色颗粒，胶本身可不被显著着色，蛋白染色灵敏度得以提高。而在改良考马斯亮蓝染色法中，在高酸、高离子环境下，蛋白质的葡糖胺和天冬酰胺酸质子化，更利于与染色剂发生结合。甲醛在银染中发挥还原剂作用，使结合在蛋白质上的银还原而显色。甲醛浓度影响银染效果，浓度一般为400～500μl/L。甲醛浓度较高时胶颜色发黄，背景色混杂，难以发现目的点;浓度较低不仅染色时间延长，而且不易着色。银的络合剂硫代硫酸钠防止自由银离子还原为金属银，可减少非特异染色，降低背景染色，其浓度一般为0.1～0.2mg/L。该络合剂用量过多，胶颜色过深;少则