(2.3)--内外蔗糖酶采用蛋白印迹技术处理实验开题报告.ppt

学生：陶xx刘xx杨xx内外蔗糖酶采用蛋白印迹技术处理实验Westernblot实验一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术

01实验目的和意义Purposeandsignificance02国内外研究现状Researchstatus03实验的主要内容Experimentcontent04实验计划及安排Experimentplanarrangement目录CONTENTS

实验目的和意义PurposeandsignificancePART.01

研究目的研究目的作为分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。电泳蛋白质检测关键词通过观察我们被考马斯亮蓝处理后的凝胶，我们只能得到深浅不同，位点不同的蓝色条带，并不能直接得到需要提取的酵母蔗糖酶到底在那个条带上，以及他的含量，通过蛋白印迹可以通过westernblot探究蛋白质位点，得到SDS凝胶上酵母蔗糖酶的Rf值。同时我们发现在提取酵母蔗糖酶时样品四中，有两只样品出现了蔗糖酶活性被检测出来，经过判断，可能是有部分的内蔗糖酶被提取出来，我们也通过蛋白印迹在凝胶上找到对应内蔗糖酶位点，与外蔗糖酶进行对比。并且通过去糖基化手段，对于两种蔗糖酶的去糖基化以及未去糖基化的Rf值做对比

国内外研究现状ResearchstatusPART.02

研究历史在1979年9月HarryTowbin的团队则应用现在众所周知的蛋白电泳转移原理，成功将蛋白从SDS胶转移到硝化纤维膜介质。诞生了我们在后续自主实验中使用的“三明治”湿转法有西雅图Burnette的团队在1879年拒稿，1981年发表的相关工作中对于蛋白质印迹首次命名“westernblot”。任职斯坦福大学的GeorgeStark和他的同事通过蛋白被动转移及碘125标记的蛋白A作为实现蛋白印迹的手段。在1979年4月提交了论文，并于1979年7月发表?。

研究应用01分离分子印迹技术对模板分子具有选择性识别能力的特点,利用这种技术制得的蛋白质MIP(分子印迹聚合物)有良好的特异识别性。抗体模拟物某些已经制备得到的蛋白质MIP具有类似于抗体或受体的高度特异识别性,因此它可以替代天然的抗体在免疫分析和酶联免疫分析(ELISA)中得到应用。

生物传感器由识别元件和与其紧密接触的转换元件组成,可以将对分析物产生的响应信号变成输出信号,具有高度特异性的蛋白质MIP在这个领域具有巨大的潜力。0203

研究现状研究现状目前虽然在蛋白质印迹技术上已经有了许多成果,但是仍然存在一些问题:有关蛋白质MIP这方面机理的研究还相对肤浅,印记分子的可接近性和分子扩散的无阻碍性条件严苛。因而寻找一些新的功能单体、交联剂和印迹方式也是蛋白质印迹中面临的一个挑战;蛋白质印迹应用最多的是利用非共价键作用,但蛋白质在有机溶剂中会有变性的可能,水中则由于水的极性较强,会导致这种非共价作用变弱。这一矛盾也成为阻碍分子印迹在蛋白质大分子上应用的难题之一;寻找一种有效洗脱蛋白质的手段。虽然现阶段的研究工作中都可以成功洗脱蛋白质分子,但是洗脱后的活性蛋白质无法回收利用。尽管存在以上问题,但是随着分子印迹技术的不断发展,蛋白质的印迹技术上存在的问题会得到最大程度的解决,蛋白质MIP的应用也会越来越广泛。

实验的主要内容experimentcontent实验流程与试剂选择PART.03

实验框架实验内容电泳转膜免疫测定电泳在技术上我们主要采用的就是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，依据不同蛋白质的分子量来对蛋白质进行有效分离。原理：根据蛋白质样品所带的电荷和分子质量的差异性进行分离；在电泳过程中仍保持蛋白质的天然构象、亚基之间的相互作用及其生物活性。将凝胶中的蛋白质分子从凝胶中转移到膜上，转移后，蛋白质就直接暴露在膜上，便于与抗体结合。原理：电转印是蛋白免疫印迹中最常见的转印方法，即使用电场力驱动蛋白从凝胶中洗脱转移到膜上。膜和凝胶放置在一起，并在两个电极之间放置滤纸。在电极之间施加电压，蛋白在电场力的作用下迁移到膜上。首先用靶蛋白特异性的非标记抗体与靶蛋白的抗原决定簇相结合，再用蛋白质检测方法来检测蛋白质在膜上位置。蛋白检测ECL发光法。原理：在辣根过氧化物酶（HRP）的催化作用下，鲁米诺与过氧化氢反应生成过氧化物，不稳定随即分解，形成一种能发光的电子激发中间体，当后者由激发态返回至基态，就会产生荧光。

国内外研究现状膜的选择A.硝化纤维素膜和增强型硝化纤维素膜硝酸纤维素膜很容易在水或转印缓冲液中润湿，并且与多种蛋白检测方法兼容作为固定媒介研究抗原