细胞融合的方法、过程和影响因素.ppt

二、诱发细胞融合的方法病毒化学－PEG电融合1.病毒促进细胞融合病毒类融合剂是研究的最早的促融剂，一些致癌、致病病毒如疱疹病毒、天花病毒、副流感型病毒、副黏液病毒等，都能诱导细胞融合，但由于毒性大，应用上收到很大限制。仙台病毒（HVJ）是一类被膜病毒，诱导细胞融合的不是仙台病毒内部的RNA，而是它的外膜。这一现象对你有何启示？HVJ促融机制：当病毒位于两个细胞间时，病毒表面spike上神经氨酸酶降解细胞膜上的糖蛋白，使细胞膜局部聚集在病毒周围，在高pH和Ca2+条件下局部细胞膜发生融合。2.化学融合剂促进细胞融合1975年Kao和Chayluk报道PEG(polyethyleneglycol,PEG)可促进细胞融合，Pontecorvo报道PEG促融效率高于仙台病毒100-300倍。PEG是一种多聚化合物，商品名卡波蜡Carbowax,分子量200－20000，靠醚键的联结使其分子末端带弱负电荷，目前已衍生达50多种。聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合原理：PEG带有大量的负电荷,和细胞膜表面的负电荷在Ca2＋的连接下，形成静电键，促使异源的细胞膜间的粘着和结合，在高pH,高Ca2＋溶液的作用下，将Ca2＋和与质膜结合的PEG分子洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种细胞膜上的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。注意事项1PEG融合的关键是作用时间2PEG规格和纯度与融合效率有关3融合与细胞密度有关4融合液中加入少量CaCl2，即维持一定电导率，对细胞也有保护作用3.电融合技术（Electroporation）3注意事项1）对介质要求高，一般用高纯度的蒸馏水并选用适当的非电介质溶液，如甘露醇等配制等渗性介质。2）注意控制高频交流电压和直流脉冲电压的强度和时间，以防止细胞连接成串或发生可逆性降解。融合参数：主要包括交流电压、交变电场的振幅频率、交变电场的处理时间；直流高频电压、脉冲宽度、脉冲次数等。优点：融合率高，达70％－80％，甚至100％融合率＝（融合组多核细胞的核数－对照组多核细胞的核数/对照组的全部细胞数）×100％可在显微镜下定向诱导细胞融合可直接挑选杂种细胞???原理：两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细胞，筛选的目的是获得优良的杂种细胞。???1）亲本???2）同核体homokaryon：同源细胞融合体，它们的基因型和表现型完全一样。???3）异核体heterokaryon：异源细胞的融合体，它们含有双亲细胞核和细胞质物质。???4）多核体：含有双亲不同比例核物质的融合体???5）异胞质体：具有不同胞质来源的杂合细胞。???6）核质体：有细胞核而带有少量细胞质的亚原生质体第二节融合细胞的筛选动物细胞融合的筛选方式：1）利用抗药性筛选系统：利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞。亲本A：对氨苄青霉素敏感，对卡那霉素不敏感亲本B：对卡那霉素敏感，对氨苄青霉素不敏感杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长2）营养互补筛选系统：细胞在缺乏一种或几种营养成分时，不能生长繁殖，即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞。亲本A：色氨酸缺陷型亲本B：苏氨酸缺陷型杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，而亲本细胞均会死亡。3）温度敏感突变型杂种细胞的筛选：一般的培养细胞能在37度范围内生长，但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。亲本一：具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生长。亲本二：高温敏感突变型，但不能抗卡那霉素。杂种细胞能在高温和含卡那霉素的培养基上生长。4具有所需性状杂种细胞的筛选HAT选择系统－－基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选HAT是含一定浓度次黄嘌呤（Hypoxanthine,H）、氨基喋呤（Aminopterin，A）及胸腺嘧啶核苷（Thymidine，T）的一种选择性培养基，其中三种成分与细胞DNA合成有关。DNA合成途径有两种:需两种酶：胸腺嘧啶核苷激酶TK酶:（催化胸腺嘧啶核苷产生脱氧胸苷酸）次黄嘌呤磷酸核苷转移酶HGPRT酶:（催化次黄嘌呤产生肌苷）主要途径由氨基酸和其他小分子化合物合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸是必不可少的媒介，参与嘌呤和嘧啶甲基合成，氨基蝶呤抑制FH2活性，阻断FH2到FH4合成。杂交瘤技术中，常选用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷（HPRT-）骨髓瘤细胞或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤细胞为亲本之一。HPRT-细胞的嘌呤只能由全合成途