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流感嗜血杆菌保存方法比较

【关键词】嗜血菌/流感;标本;保存/生物学

在微生物检验工作中，成功进行细菌菌种保存，对于研究细菌的生物学特征、探讨耐药性变异的机理、监测医院感染病原流行趋势以及开发新药等至关重要。我教研室为了将临床分离的流感嗜血杆菌保存下来，以备将来进行单克隆抗体制备、疫苗研制等项研究，我们尝试了四种流感嗜血杆菌的保存方法，其中包括：甘油血清肉汤法、脱脂牛乳法、纸片法和真空冷冻干燥法。保存1个月、3个月、6个月、1年后将菌种复苏进行了比较，试图从中找到一个最佳的保存方法。

1材料与方法

1.1菌种及标本来源临床菌株为河北北方学院附属第一医院儿科门诊及幼儿园正常儿童咽部的分离株，共32株，均通过卫星现象鉴定为流感嗜血杆菌。

1.2方法

1.2.1甘油血清肉汤法甘油肉汤按照1∶1混匀后121.3℃15min，冷却后无菌加入10%血清混匀，取0.5mL分装于1mLeppendorf中，放于支架上合盖但勿盖严，挑取巧克力平板上生长旺盛的流感嗜血杆菌数个菌落研磨于此培养基中，4℃冰箱稳定1h之后，放入-20℃保存。

1.2.2脱脂牛乳法[1]买来新鲜牛乳煮沸5次，完全脱脂后取0.5mL分装于1mLeppendorf中，放于支架上合盖但勿盖严115.6℃15min。挑取流感嗜血杆菌数个菌落研磨于此培养基中，4℃冰箱稳定1h之后，放入-20℃保存。

1.2.3纸片法[2]保存菌种滤纸片购自OXOID公司的Ⅴ+Ⅹ因子无菌纸片;保存菌种玻璃瓶：临床青霉素玻璃小瓶用浓度10%的84消毒液浸泡12h，用洗洁精洗涤后，用清水冲洗5次，最后用蒸馏水冲洗10次，温箱烘干后高压灭菌备用。用无菌小镊子夹住Ⅴ+Ⅹ因子滤纸片，用无菌接种环挑取流感嗜血杆菌涂划于其上，小心放入菌种保存玻璃瓶内，每瓶一片并做标记。将装有菌片的玻璃瓶放置在-20℃塑封保存。

1.2.4真空冷冻干燥法[3]冷冻干燥箱、干燥机等。流感嗜血杆菌纯培养物接种于37g/L牛心浸液+0.03%氯化血红素+0.01%辅酶Ⅰ中培养36h后，用无菌毛细管吸取菌液放到eppendorf中，于-20℃冰箱稳定1h，然后放置到冷冻干燥机干燥箱内冻干，抽真空后4℃冰箱保存。

1.3复苏鉴定

分别在上述菌种保存1个月、3个月、6个月、1年的不同时期，取出进行复苏鉴定。甘油血清肉汤法和脱脂牛乳法保存的菌种，从冰箱取出溶解后直接倾注于巧克力平板上;纸片法和真空冷冻干燥法保存的菌种，取出后放入0.5mL无菌盐水中，充分振摇混匀后，放入35℃的中孵育30min，然后分别将菌液倾注于巧克力色平板，放入烛缸，35℃培养24～48h，观察各菌株存活情况，并转种血平板进行卫星现象鉴定，排除污染的可能性。

1.4统计学处理所得数据用χ2检验行统计分析。

2结果

采用四种方法保存32株流感嗜血杆菌，1个月、3个月、6个月、1年效果比较见表1。

2.1脱脂牛乳法保存1个月、3个月和6个月之间差异无统计学意义(P0.05);但1年保存存活率明显下降53.1%，与1个月、3个月和6个月比较差异有显著性(P0.01)。

2.2真空冷冻干燥法四个时间段保存流感嗜血杆菌存活率之间差异无统计学意义(P0.05)。

2.3甘油血清肉汤法与脱脂牛奶保存法及真空冷冻干燥法在相同时间段存活率比较，差异有统计学意义，其中1个月存活率比较P0.01;而3个月、6个月、1年存活率比较P0.001。

2.4纸片法与脱脂牛奶保存法及真空冷冻干燥法在相同时间段存活率比较，差异有统计学意义(P0.001)。表132株流感嗜血杆菌不同保存方法存活率对比(%)

保存方法1个月存活率3个月存活率6个月存活率1年存活率甘油血清肉汤法43.9(7/32)21.9(7/32)18.8(6/32)6.3(2/32)脱脂牛乳法93.8(30/32)87.5(28/32)87.5(28/32)53.1(17/32)纸片法6.3(2/32)6.3(2/32)3.1(1/32)0真空冷冻干燥法96.9(31/32)96.9(31/32)93.8(30/32)93.8(30/32)

3讨论

由于流感嗜血杆菌生存能力较差，需及时转种及保存，即使在4℃冰箱内一旦菌种放置时间超过3d，再次转种也不易获得成功[4]。通过反复探究我们总结出以上四种主要的保存方法，从其复苏后存活率对比来看，用真空冷冻干燥法流感嗜血杆菌平均存活率为93.8%～96.9%，此法是先将细菌在低温中迅速冷冻，然后在高真空状态下迅速脱水干燥，真空密封而成。虽然效果最好，但此法操作繁琐、费时、费力，需价格昂贵的冷冻真空干燥箱和真空泵等设备故成本较高，给实际工作带来诸多不便[5]。甘油血清肉汤