《植物生理学实验》实验02-叶绿体色素的提取、分离及理化性质的鉴定.pptx

2019-2020学年春季学期植物生理学实验红河学院生命科学与技术学院陶宏征实验二叶绿体色素的提取、分离及理化性质的鉴定实验目的1.掌握叶绿素提取和分离的原理及方法2.了解叶绿素性质及其鉴定方法实验原理叶绿素的概念叶绿素提取的原理叶绿素分离的原理叶绿素的几个理化性质叶绿素的概念叶绿素主要包括叶绿素a和b，是植物进行光合作用的主要色素，和叶黄素、胡萝卜等色素一起均存在于叶绿体中分子式:ChlaC55H72O5N4Mg/ChlbC55H70O6N4Mg结构式:卟啉环化合物四个吡咯环与四个=CH-组成一个大环,共轭双键形成一个大π键,环中央有一个镁原子,卟啉环决定叶绿素颜色,也是吸收可见光,并以诱导共振方式传递光能的根本所在,叶醇尾是由四个异戊二烯单位组成的双萜;卟啉环头部呈极性,具亲水性;叶醇尾部具亲脂性叶绿素的重要作用：叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，起着吸收光能和传递光能的作用，此外叶绿素有造血、提供维生素、解毒、抗病等多种用途。叶绿素提取的原理叶绿素以及叶绿体的叶黄素和胡萝卜素等均可在有机溶剂中的溶解特性可用丙酮或酒精灯有机溶剂将它们从叶片中提取出来。叶绿素分离的原理原理1：叶绿体色素（叶绿素和类胡萝卜素等）在不同有机溶剂中的溶解度不同以及在吸附剂上的吸附能力不同，可以据此原理将它们彼此分离开。原理2：叶绿素是一种双羧酸的酯，可与碱发生皂化作用，产生的盐能溶于水，二类胡萝卜素不能与碱发生皂化反应，可据此原理将叶绿素与类胡萝卜素分开叶绿素的几个理化性质物理特性：光学特性荧光现象：Chl溶液在透射光下呈绿色，而反射光下呈红色的现象。强度大，寿命短（10-9秒）磷光：Chl溶液停止光照后，仍能在一定时间内放出暗红色的光。寿命长（10-2秒——10-3秒）（无法观察到）化学特性：皂化反应叶绿素是一种双羧酸的酯，可与碱发生皂化作用，产生的盐能溶于水，而叶黄素不能发生皂化反应，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开化学特性：光不稳定性叶绿素在叶绿体中与蛋白质及酶形成复合物，具有稳定性，但在分离出来后，在光下会发生氧化作用,被光解为一系列小分子物质而褪色.化学特性：镁的置换反应叶绿素中的镁可被H+取代而生成褐色的去镁叶绿素；加人铜盐作用，后者则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色植物的浸渍标本实验用品材料：新鲜植物叶片仪器：大试管或展层缸，天平，研钵，量筒，烧杯，漏斗，软木塞，滤纸，毛细滴管，剪刀，分液漏斗，移液管，分光计试剂：丙酮，甲醇，醋酸酮，盐酸，氢氧化钾，石英砂，碳酸钙，无水硫酸钠，四氯化碳，乙醚操作步骤叶绿体色素的提取与分离01．称取新鲜叶片2小放人研钵中加丙酮5mL，少许碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆，再加丙酮10mL，以漏斗过滤之。即为色素提取液。放于暗处备用，02．把层析用的滤纸剪成2cmx20cm的纸条，将其一端剪去两侧，中间留一长约1．5cm，宽约0．5cm的窄条：03．用毛细滴管吸取叶绿素溶液点于窄条的上方，注意一次所点溶液不可过多，风干后再点，这样重复点几次，使展层后效果好一些。04．在大试管或展层缸中加人四氯化碳3~5mL及少许无水硫酸钠：然后将滤纸条固定于软木塞上，插入试管内，使窄条浸入溶剂中(色素点要略高于液面，滤纸条边缘不可碰到试管壁)，盖紧软木塞，直立于阴暗处进行层析(图3—1)：待溶剂前沿达滤纸条上沿1．5、2．0cm时，取出滤纸条，立即用铅笔在溶剂前沿划线作记号：并观察分离后色素带的分布-最上端橙黄色为胡萝卜素，其次黄色为叶黄素，再下面蓝绿色为叶绿素a，最后的黄绿色为叶绿素b叶绿体色素的理化性质的鉴定01皂化反应-黄色素与绿色素的分离取上述色素丙酮提取液10mL，加到盛有20mL乙醚的分液漏斗中，摇动分液漏斗，并沿漏斗边缘加入30mL蒸馏水，轻轻摇动分液漏斗，静止片刻，溶液即分为两层：色素已全部转入上层乙醚中，弃去下层丙酮和水，再用蒸馏水冲洗乙醚溶液l-2次。然后于色素乙醚溶液中加入5mL30%KOH甲醇溶液，用力摇动分液漏斗，静置约10min，再加蒸馏水约10mL，摇动后静置分离，则得到黄色素层和绿色素层，分别保存于试管中。02叶绿素的荧光现象取上述色素丙酮提取液少许于试管中，分别观察在反射光和透射光一侧，提取液的颜色有无不同：反射光侧观察到的血红色，即为叶绿素产生的荧光颜色03叶绿素的光不稳定性取上述色素丙酮提取液少许分装于2支试管中，1支试管放在黑暗处(或用黑纸包裹)，另一支试管放在强光下，经2—3h后，观察两支试管中溶液的颜色有何不同。04铜代反应取上述色素丙酮提取液少许于试管中，l滴1滴加浓盐酸，直至溶液出现褐绿色，此时叶绿素分子已遭破坏，形成去镁叶绿素。然后加醋酸铜晶体少许，慢