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小分子与蛋白体外相互作用测定方法

⊙编辑：小余

生物分子相互作用是一种基本的生命现象，其相互作用研究是现代生命科学研究的重大问题之一。现在研究相互作用的技术有：平衡透析法、紫外可见吸收光谱、荧光光谱、电化学法等。随着分子生药研究深入，一些新的检测技术问世，如微量热泳动技术（MST），那么当我们做蛋白相互作用时，面对如此多的技术，该如何让选择？笔者将目前测定小分子与蛋白的体外相互作用，最常用的四种技术：荧光偏振免疫分析法（fluorescencepolarizationimmunoassay，FPIA）、等温量热滴定仪（ITC）、表面离子体共振技术（SPR）等技术的原理、操作、应用范围以及优缺点做一综述，供各位研究者参考。其中FPIA和ITC是两种经典方法。

1.荧光偏振免疫分析法（fluorescencepolarizationimmunoassay，FPIA）

1.1原理

FPIA是一种定量免疫分析技术，其基本原理是荧光物质经单一平面的蓝偏振光（485nm）照射后，吸收光能跃入激发态，随后回复到基态，并发出单一平面的偏振荧光（525nm）。偏振荧光强弱程度与荧光分子的大小呈正相关，与其激发时的转动速度呈反相关。FPIA最适宜检测小至中等分子物质，常用于药物、激素的测定。

1.2操作

1.2.1首先针对所测蛋白，选择一个阳性药物，对阳性药物进行荧光标记；

1.2.2配制一系列浓度的标准抗原（厂家在试剂盒中提供提供已知剂量的非标记抗原）；

1.2.3用一系列已知浓度的标准抗原与一定量的标记抗原在一定条件下同限量的特异性抗体进行反映；

1.2.4反应达到平衡后，以反应变量作为纵坐标，反应剂量（一系列标准抗原）作为横坐标，做一条曲线，就得到不同浓度的标准抗原对反应变量的竞争抑制曲线；

1.2.5在同等条件下，用待测抗原与一定量的标记抗原与限量的特异性抗体进行反应，并用同样的方法分离待测抗原中的B和F，测量其放射性，计算出B/F，在剂量反应曲线上就可以查出对应的抗原浓度。

1.3注意

在实际操作中要设置：一是标准抗原量为0，这是没有标准抗原与标记抗原竞争，标记抗原和抗体结合达最大值；二是为了排除标记抗原再发特异性结合时出现非特异性结合（与杂质蛋白和容器的管壁结合等），设置一个非特异性结合管(NSB)，NSB管用蒸馏水代替特异抗体，在相同条件下反应后测的放射性。

1.4优缺点

1.4.1优点

检测限低，0.2ng/ml，精密度高，速度快，样品用量少，仪器不用每日校准，有颜色和浑浊的溶液不干扰检测结果；

1.4.2缺点

仪器设备昂贵，药品试剂盒专属性强，需进口，测一种特异性抗体，需要一种标记抗原。

2.等温量热滴定仪（ITC）

2.1原理

ITC是一种量热或分析技术，即用一种反应物滴定另一种反应物，随着加入滴定剂的数量的变化，测量反应体系温度的变化。滴定一般在尽可能接近绝热的条件下进行，被滴定物可以是液体或悬浮的固体；滴定剂可以是液体或气体。温度变化是由滴定剂与被滴定物间的化学作用或物理作用（例如一种有机分子吸附于固体表面）引起的。在一次实验中可以测定结合的亲和力常数K，结合反应中的焓变、熵变，结合位点，也可以测定有多个结合位点的样品。

2.2操作

2.2.1样品池中加入待测大分子；

2.2.2参照池中加入缓冲液；

2.2.3将待测配体吸入注射器中；

2.2.4注射器置于样品池中；

2.2.5调整温度、搅拌速度和每次注射体积。

2.3应用

分子相互作用（蛋白、核酸、多肽、药物分子、脂类、金属离子、小分子等等）、工艺过程的开发和控制、酶动力学、药物研发、非生物系统等。

2.4优点

2.4.1无需荧光标记，因为荧光素对大分子的结构或空间结构会有影响；

2.4.2操作简单（整个过程由计算机控制，再由Origin软件分析ITC所得数据，减少了人为误差给实验带来的影响）；

2.4.3样品用量小，方法灵敏度和精密度高。（滴定池有两种配制：1ml--所需配体100ul和250ul；190ul---所需配体50ul）；

2.4.4测定时不需要制成透明清澈溶液，而且量热试验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析等。

3.表面离子体共振（SPR）

3.1原理

表面等离子共振是一种物理光现象。利用光在玻璃界面处发生全内反射时的消逝波，可以引发金属表面的自由电子产生表面等离子体子在入射角或波长为某一适当值的条件下，?表面等离体子与消逝波的频率和波数相等，?二者将发生共振，入射光被吸收，使反射光能量急剧下降，在反射光谱上出现共振峰(即反射强度最低值)。当紧靠在金属薄膜表面的介质折射率不同时，?共振峰位置将不同。

3.2操作

3.2.1准备偶联物和分析物，纯度高的偶联物有利于特异性结合的分析判断及结合