化合物表征技术-高效液相色谱法.ppt

*柱塞式往复泵*隔膜式往复泵:与柱塞式往复泵相似,只是流动相接触的不是活塞,而是具有弹性的不锈钢或聚四氟乙烯隔膜.隔膜经液压驱动脉冲式地排出或吸入流动相.优点:避免流动相被污染.*自动进样装置示意图

自动进样器由进样阀、样品管、进样针头、样品瓶和支架等组成，下图是一自动进样装置工作原理示意图，样品放在支架上的样品瓶中，移动支架让样品瓶对准针头，下降针头刺破样品瓶上的膜吸入样品入样品环，升起针头使样品瓶移开，针头再复位。进样流动相从六通阀的１到２经过针头和定量管把样品顶入色谱柱。3.2.7亲和色谱原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱3.2.8分离类型选择**3.2高效液相色谱仪**HPLC主要的部分是高压输液系统、分离系统、进样系统、检测系统、微机控制与数据系统。**3.3高压输液系统4.3.1贮液罐和脱气装置贮液系统①足够容积(0.5－2L)；②脱气方便；③耐一定压力；④材料是惰性的。脱气方法①低压脱气，电磁搅拌，水泵抽真空，加热。②以He脱气，He在液体中溶解度最小。**③超声波脱气。④在线真空脱气。**泵体材料耐腐蚀泵腔的体积要小，以便快速更换溶剂能在高压下连续工作,耐压25-50MPa压力平稳，无脉冲高压输液泵输出流量稳定，重复性高,输出流量范围宽3.3.2高压输液泵**高压输液泵恒流泵恒压泵注射型泵往复型泵双泵头往复式柱塞泵双柱塞往复式串联泵**1.往复柱塞式恒流泵**隔膜式往复泵**2.恒压泵3.3.3梯度洗脱装置**低压高压3.4进样系统**流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：**流程3.5分离系统**柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。**3.5.1固定相厚度1－2μm，直径10－25μm直径2－10μm，孔径2－100nm，比表面积约300m2/g液相色谱柱填料尽管有有机高分子、石墨化碳、氧化铝、氧化钛，氧化锆等，但仍多以硅胶作基质。1.表面多孔固定相(硅胶)2.全多孔微粒固定相(硅胶)现在最广泛采用的填料是全多孔微粒硅胶**化学键合固定相虽然可将固定液机械地涂附在上述表面多孔硅胶或全多孔硅胶上作固定相，但有许多缺点，因此现在多采用化学键合固定相，化学键合固定相是在表面多孔或全多孔硅胶(多采用后者)表面上利用化学反应法通过化学键把有机分子结合在载体表面。键合基团类型：疏水基团，如C8、C18；②极性基团，如丙氨基(-C3H6NH2)、氰乙基(-C2H4CN)；③离子交换基团，如阴离子交换(-NR3Cl)、阳离子(-SO3H)。****键合途径：①Si—O—C键型②Si—O—Si—C键型③Si—C键型**④Si—N键型优点：使用过程不流失;化学稳定性好;热稳定好;载样量大;适宜作梯度洗脱。****3.5.2流动相正相色谱极性：流动相﹤固定相反相色谱极性：流动相﹥固定相a.流动相纯度要高，与固定相不相溶，不发生化学反应b.价格便宜，毒性小，易于纯化c.对试样溶解度适宜，不发生沉淀d.粘度小e.与检测器匹配极性顺序：水乙腈甲醇四氢呋喃环己烷煤油**采用二元或多元溶剂系统：底剂+洗脱剂正相色谱底剂：低极性，如：环己烷、苯、氯仿等。洗脱剂：极性较强，如：醚、酯、酸等。反相色谱底剂：强极性，如：水。洗脱剂：较强极性，如：甲醇、乙腈、四氢呋喃正相色谱低极性流动相反相色谱高极性流动相中等极性流动相中等极性流动相时间时间时间时间待测物极性：ABC正、反相色谱中极性和保留时间的关系3.6检测系统*性能紫外可见荧光示差折光蒸发光散射类型梯度洗脱最小检出量对流速敏感度对温度敏感度选择型可以0.1-1ng不敏感不敏感选择型可以10-3-10-2ng不敏感不敏感通用型不可以102-103ng不敏感敏感通用型可以0.1-10ng不敏感不敏感**1.