高效液相色谱法.ppt

高效液相色谱法();第1节高效液相色谱仪;HPLC所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵的工作；还会影响检测器的正常响应。;（二）高压输液泵;输液泵按输出液恒定的因素分恒压泵和恒流泵，恒流泵的应用更广泛。;（三）梯度洗脱装置;等度洗脱与梯度洗脱;高压梯度（外梯度）:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱;二、进样系统;三、分离系统;四、检测系统;紫外检测器包括固定波长、可变波长和光电二极管阵列检测器;1024个二极管阵列10ms完成一次检测，1s采集100000个含吸光度、波长、时间的数据，得到一张吸光度、波长、保留时间的三维色谱图。;灵敏度高；

线性范围宽；

流通池可做得很小(1mm×10mm，容积8μL)；

对流动相的流速和温度变化不敏感；

波长可选，易于操作；

可用于梯度洗脱。;15;（三）示差折光检测器;（四）蒸发光散射检测器;;五、数据记录处理和计算机控制系统;第2节基本理论;2.分子扩散项;22;a.移动流动相传质阻力（Cmu）;24;流动相在色谱柱中流动时，有部分流动相进入到多孔的固定相深孔中，滞留后难以流动。组分分子进入滞留区造成色谱峰扩展，使柱效降低，;在高效液相色谱中，范第姆特方程可写成：

H＝A+Cu＝A+Cmu+Csmu;为了减小柱内展宽，提高柱效，可采取以下措施：;采用小体积检测器，管道对接宜呈流线形，减少柱外死体积，从而减小柱外展宽，提高柱效。;HPLC

高效液相;一、吸附色谱法;a.表面多孔型b.无定形全多孔c.球形全多孔d.堆积全多孔;（一）化学键合固定相;由于空间位阻效应，不可能将较大的有机官能团键合到全部硅醇基上，使得部分硅醇基未反应。;34;2.键合相的分类;1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯;（2）中等极性键合相;3.键合相的性质;高碳ODS键合相：若R1、R2是二个甲基，构成高碳ODS键合相

［Si-O-Si(CH3)2-C18H37］。

中碳ODS键合相：若R1是氢，R2是氯，氯与硅胶的另一个硅醇基脱HCl，则生成中碳ODS键合相

［（Si-O-)2Si(H)-C18H37］；

低碳ODS键合相：若R1??R2都是氯，与硅胶的另二个硅醇基再脱二分子HCl，生成低碳ODS键合相

［(Si-O-)3Si-C18H37］。;（3）表面覆盖度;（二）正相键合相色谱法;分离选择性：

极性强的组分k大，后洗脱出柱。

流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分k减小，tR减小。;（二）反相键合相色谱法;疏溶剂理论把非极性的烷基键合相，看作是在硅胶表面上覆盖了一层键合的烷基的“分子毛”，这种“分子毛”有强的疏水特性。;保留行为的主要影响因素

1、溶质的分子结构（极性）

极性越弱，疏水性越强，k越大，tR也越大。

同系物碳数越多，极性越弱，k越大；;稠环芳烃的分析;反相键合相色谱法是应用最广的色谱法，主要用于分离非极性至中等极性的各类分子型化合物.派生的离子抑制法、离子对法还可用于酸、碱、盐的分析。;原理;影响容量因子的因素;分析碱类或带正电荷的物质：用烷基磺酸盐或硫酸盐，如正戊烷基磺酸钠（PICB5）、正己烷基磺酸钠（PICB6）、;（四）离子抑制色谱法;2．容量因子及其影响因素

除与反相色谱法有相同的影响因素外，主要受流动相的pH值的影响。对于弱酸，;3．适用范围

适用于3.0≤pKa≤7.0的弱酸；6.0≤pKb≤7.0的弱碱。对于pKa＜3.0的酸及pKb6.0的碱，应采用离子对色谱法或离子交换色谱法。;（四）分离类型的选择;第4节改善分离度的方法;一、对流动相的要求;④与检测器匹配;通常希望组分的容量因子k保持在2~10范围内，若组分的k值大于10或小于2时，可通过调节流动相的极性，来获取适用的k值。;在反相色谱中则常采用水为主体溶剂，加入甲醇、乙腈、四氢呋喃等来调节溶剂的洗脱强度，;表中溶剂极性参数P‘越大，溶剂的极性越强，在反相色谱中的洗脱能力越弱，保留时间延长。;2.加入改性剂改善选择性和峰形;3.梯度洗脱;A溶剂为高强度（甲醇或乙腈）

B溶剂为低强度（水）