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高效液相色谱法试验操作规程

目的：建立一个高效液相色谱法试验操作规程，保证此项工作顺利进行。

范围：原料、中间体、成品检验。

责任：检验员、QA监控员、化验室主任、质保科科长、质量部负责人。

内容：

高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行

分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并进

入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。

1.对仪器的一般要求和色谱条件

高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统

组成。色谱柱内径一般3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。超高效液相色谱仪是适

应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液

相色谱仪。

1.1色谱柱

反向色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常用的载体有

硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等。常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷

键合硅胶和苯基键合硅胶等。

正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常用的填

充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可作反

向色谱。

离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴

离子交换色谱柱。

手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。

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系统使用离子交换填充剂；分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多空微球等填充

剂；对应异构体的分离通常使用手性填充剂。

色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团

的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，

应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。

温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化

的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但不宜超过60℃。

残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在2~8之间。残余硅羟基已

封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH

值小于2或大于8的流动相。

1.2检测器

最常用的检测器为紫外-可见分光光度计检测器，包括二极管阵列检测器（DAD）、

其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器

和质谱检测器等。

紫外-可见分光光度计检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响

应值不仅与被测物质的量有关，还与其结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器

为通用型检测器，对所有的物质均有响应；结构相似的物质在蒸发光散射检测器的响应

值几乎仅与被测物质的量有关。

紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与

被测物质的量在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量

通常呈指数关系，一般需经对数转换。

不同的检测器，对流动相的要求不同。紫外-可见分光检测器所用流动相应符合紫

外-可见分光光度法(通则0401)项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机

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溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器不得使

用含不挥发性盐的流动相。

1.3流动相

反相色谱系统的流动相常用甲醇-水系统和乙腈-水系统，用紫外末端波长检测时，

宜选用乙腈-水系统。流动相中应尽可能减少不用缓冲盐，如需用时，应尽可能使用低

浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动相中有机溶剂一般应不低于5%，

否则易将导致柱效下降、色谱系统不稳定。

正相色谱系统的流动相常用两种或两种以上的有机溶剂，如二氯甲烷和正己烷等。

品种正文项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其

余如色谱柱内径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、

检测器灵敏度等，均可适当改变，以达