高效液相色谱法分离苯甲酸.docVIP

仪器分析实验教案

实验题目：高效液相色谱法分离苯甲酸

教学目标：

1、了解高效液相色谱仪的基本结构及操作步骤。

2、理解反相色谱的原理及应用。

3、学习物质分离的操作条件。

教学重点：

掌握物质分离操作条件的选择方法。

教学难点：

了解高效液相色谱仪的基本结构及操作步骤

仪器药品：

LC-2010高效液相色谱仪；色谱柱VP-ODS（4.6mm×15cm）；微量注射器；高纯水；甲醇（AR）；苯甲酸（AR）；磷酸二氢钾（AR）。

教学方法：讲授、演示

教学时数：4学时

教学过程：（教师授课思路、设问及讲解要点）

一、实验原理

高效液相色谱法的原理与气相色谱法相似，但以液体为流动相，适合于分析高沸点的有机化合物、高分子、热稳定性比较差以及具有生物活性的物质。

苯甲酸具有抑制细菌生长和繁殖的作用，广泛应用于食品工业中作为防腐剂。但是苯甲酸的过量摄入，可对人们的健康造成危害：如苯甲酸进入人体后，在肝脏内与甘氨酸结合，代谢成马尿酸由尿排出，对肝脏造成一定的损害；同时口服过多的苯甲酸，在体内积蓄过多会对身体造成一定的危害。由于苯甲酸价格低廉在食品工业中得到广泛的应用，因此有必要学习苯甲酸的高效液相色谱法分离分析的操作方法以及分离条件的选择。

苯甲酸易溶于甲醇等有机溶剂，而略溶于水，因此苯甲酸为极性化合物，可以用反相色谱法进行分离分析。同时苯甲酸为弱酸性化合物，在水中存在部分电离，因此正确选择流动相的极性是决定分离好坏的关键。当采用甲醇与水作流动相时，当甲醇和水的比例不同时，流动相的极性得到改变，苯甲酸的峰形以及保留时间都有所改变，达到分离苯甲酸的目的，并可对分析情况作出正确的评价。

检测器是检测采集被分离分析物质的重要因素。一个理想的液相色谱检测器应具备以下特征：灵敏度高；对所检测的物质具有快速的响应，并且响应对流动相流量和温度变化不敏感；不引起柱外谱带扩展；线性范围宽，适用的范围广。对于紫外检测器而言，应要求被分离分析的物质在紫外检测波长范围内有吸收，同时要求流动相对在紫外区无吸收。由于苯甲酸的紫外在230nm波长处有吸收，同时甲醇和水所组成的混合流动相在紫外区无吸收，因此苯甲酸的液相色谱分离选择在230nm波长用紫外检测器进行检测。

液相色谱分离分析一般在室温下进行，因此柱温的选择不作为重点考虑的因素。

二、高效液相色谱的组成

高效液相色谱仪由贮液罐、高压输液泵、进样装置、色谱柱、检测器、记录仪和数据处理器。

三、仪器与试剂

1、仪器

LC-2010高效液相色谱仪；色谱柱VP-ODS（4.6mm×15cm）；微量注射器。

2、试剂

甲醇（AR），高纯水；苯甲酸（AR）；磷酸二氢钾（AR）。

四、实验步骤

1、按操作说明书使色谱仪正常运行，并将实验条件调节如下：

柱温：40℃；流动相的组成：甲醇：水（0.05mol/L的磷酸二氢钾，PH=3.5）=35：65；流量：1.0ml/min；紫外检测器波长：230nm。

2、标准溶液配制：准确称取0.1g干燥的苯甲酸，用无水甲醇溶解于50ml的烧杯里，再转移至100ml容量瓶中，定容，得到浓度为1mg/ml的苯甲酸甲醇溶液。

3、样品处理：将1mg/ml的苯甲酸甲醇溶液用尼龙滤头过滤，除掉溶液中的悬浮机械杂质，同时把苯甲酸甲醇溶液注入样品瓶中，待用。

4、待基线平直后，注入苯甲酸溶液5.0μL，记下苯甲酸保留时间。实验结束后，用甲醇冲洗干净色谱柱。

5、再改变流动相甲醇和水的比例为50：50，75：25，待基线平直后，再分别注入苯甲酸溶液5.0μL，考察苯甲酸的分离情况。

6、实验结束时，先后用水和甲醇冲洗干净色谱柱，按要求关好仪器。

五、结果与处理

1、指出苯甲酸在样品色谱图中的位置。

根据苯甲酸样品在色谱图上的保留值，对的苯甲酸进行定性分析。

2、苯甲酸分离情况的分析。

根据苯甲酸的峰形对苯甲酸的分离情况进行分析，探讨合适的苯甲酸液相色谱分离条件。

六、注意事项

1、若需保存，应置于冰箱中。

2、为获得良好的结果，样品的进样量要严格保持一致。

3、实验完毕后，应依次用水和甲醇冲洗干净色谱柱。

七、思考题

1、为什么要对流动相进行脱气处理？

2、如何对苯甲酸进行定性分析，苯甲酸分离结果的好坏和哪些因素有关？

八、教学后记