维生素C含量的测定(高效液相色谱法)--.docxVIP

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维生素C含量的测定(高效液相色谱法)

1．原理试样中的抗坏血酸用溶解超声提取后，以离子对试剂为流淌相，经反相色谱柱分别，其中L(+)-抗坏血酸和D(+)-抗坏血酸挺直用配有紫外检测器的液相色谱仪(波长245nm)测定；试样中的L(+)-脱氢抗坏血酸经L-半胱氨酸溶液举行还原后，用紫外检测器(波长245nm)测定L(+)-抗坏血酸总量，或减去原样品中测得的L(+)-抗坏血酸含量而获得L(+)-脱氢抗坏血酸的含量。以色谱峰的保留时光定性，外标法定量。2．试剂与设备(1)试剂偏磷酸(HPO3)n：含量(以HPO3计)≥38%,(Na3PO4·12H2O),(KH2PO4),(H3PO4);85%,(C3H7NO2S)：优级纯，(C19H42BrN)：色谱纯，(CH3OH)：色谱纯。(2)试剂配制偏磷酸溶液(200g/L)：称取2008(精确至0.1g)偏磷酸，溶于水并稀释至1L，此溶液于4℃的环境下可保存一个月；偏磷酸溶液(20g/L)：量取50mL200g/L偏磷酸溶液，用水稀释至500mL;溶液(100g/L)：称取100g(精确至0.1g)，溶于水并稀释至1L,溶液(40g/L)：称取4g，溶于水并稀释至100mL，临用时配制。(3)标准品L(+)-抗坏血酸标准品(C6H8O6)：纯度≥99%,D(+)-抗坏血酸(异抗坏血酸)标准品(C6H8O6)：纯度≥99%。(4)标准溶液配制L(+)-抗坏血酸标准贮备溶液(1.000mg/mL)：精确?????称取L(+)-抗坏血酸标准品0.0lg(精确至0.01mg)，用20g/L的偏磷酸溶液定容至10mL。该贮备液在2～8℃避光条件下可保存一周。D(+)-抗坏血酸标准贮备溶液(1.000mg/mL)：精确?????称取D(+)-抗坏血酸标准品0.01g(精确至0.01mg)，用20g/L的偏磷酸溶液定容至10mL。该贮备液在2～8℃避光条件下可保存一周。(5)设备液相色谱仪：配有二极管阵列检测器或紫外检测器，pH计：精度为0.01,天平：感量为0.1g,1mg,0.01mg，超声波清洗器，离心机：转速≥4000r/min，均质机，滤膜：0.45um水相膜，振荡器。3.检测步骤囫囵检测过程尽可能在避光条件下举行。(l)试样制备液体或固体粉末样品：混合匀称后，应立刻用于检测。水果、蔬菜及其制品或其他固体样品：取100g左右样品加入等质量20g/L的偏磷酸溶液，经均质机均质并混合匀称后，应立刻测定。(2)试样溶液的制备称取相对于样品约0.5～2g(精确至0.001g)混合匀称的固体试样或匀浆试样，或吸取2～10mL液体试样[使所取试样含L(+)-抗坏血酸约0.03～6mg]于50mL烧杯中，用20g/L的偏磷酸溶液将试样转移至50mL容量瓶中，振摇溶解并定容。摇匀，所有转移至50mL离心管中，超声提取5min后，于4000r/min离心5min，取上清液过0.45um水相滤膜，滤液待测[由此试液可同时分离测定试样中L(+)-抗坏血酸和D(+)-抗坏血酸的含量]。(3)试样溶液的还原精确?????吸取20mL上述离心后的上清液于50mL离心管中，加入10mL40g/L的L-半胱氨酸溶液，用100g/L溶液调整pH至7.0～7.2，以200次/min振荡5min。再用调整pH至2.5～2.8，用水将试液所有转移至50mL容量瓶中，并定容至刻度。混匀后取此试液过0.45um水相滤膜后待测[由此试液可测定试样中包括脱氢型的L(+)-抗坏血酸总量]。若试样含有增稠剂，可精确?????吸取4mL经L-半胱氨酸溶液还原的试液，再精确?????加入1mL甲醇，混匀后过0.45um滤膜后待测。(4)仪器参考条件色谱柱：C18柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5um，或同等性能的色谱柱。检测器：二极管阵列检测器或紫外检测器。流淌相：A:6.8g和0.91g，用水溶解并定容至1L(用磷酸调pH至2.5～2.8)B：100％。按A：B=98：2混合，过0.45um滤膜，超声脱气。流速：0.7mL/min；检测波长：245nm；柱温：25℃；进样量：20uL。(5)标准曲线制作分离对抗坏血酸混合标准系列工作溶液举行测定，以L(+)-抗坏血酸(或D(+)-抗坏血酸)标准溶液的质量浓度(ug/mL)为横坐标，L(+)-抗坏血酸(或D(+)-抗坏血酸)的峰高或峰面积为纵坐标，绘制标准曲线或计算回来方程。(6)试样溶液的测定对试样溶液举行测定，按照标准曲线得到测定液中L(+)-抗坏血酸[或D(+)-抗坏血酸]的浓度(ug/mL)。(