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高效液相色谱法的分离实验
一、实验目的
1、了解高效液相色谱仪的结构。
2、掌握高效液相色谱仪的基本操作方法和主要实验条件的选择。
3、掌握液相色谱定性定量分析技术。
二、实验原理
在互不相溶的两相——流动相和固定相的体系中,当两相作相对运动时,第三组分(即溶质或吸附质)连续不断地在两相之间进行分配,这种分配过程即为色谱过程。由于流动相、固定相以及溶质混合物性质的不同,在色谱过程中溶质混合物中的各组分表现出不同的色谱行为,从而使各组分彼此相互分离,这就是色谱分析法的实质。
液相色谱由泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成,试剂瓶中的流动相被泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱内,由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数,在两相中作相对运动,经过反复多次的吸附—解吸的分配过程,各组分在移动速度上产生较大的差别,被分离成单个组分依次从柱内流出,通过检测器时,样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。
三、仪器和试剂
ThermoFisherUltimate3000高效液相色谱仪、紫外检测器、C18柱。
10~100μL移液枪,100mL容量瓶,10mL移液管,2.5mL一次性注射器,针头过滤器,100μL微量进样器。
甲醇(色谱纯)、超纯水、苯(分析纯)、甲苯(分析纯)。
四、实验步骤
1、试样的配制。
配制试样溶液,苯和甲苯溶于色谱纯甲醇中,浓度为10μL/L。(写清楚配制方法)
2、开机。
写清楚开机顺序。
3、选择实验条件。
流动相比例,流速,进样量,柱温,紫外检测器波长。
4、操作方法。
过滤、洗针、进样、流出曲线。
五、数据处理
1、色谱流出曲线图。
标出保留时间,各峰对应的组分。
2、理论计算。
计算理论塔板数和分离度。
思考题
1、紫外光度检测器是否适用于检测所有的有机化合物,为什么?
2、流动相为什么要进行脱气操作?
3、进样前,试样溶液为什么要用针头过滤器过滤?
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