PCR实验室标本管理、生物安全和防污染策略.ppt

PCR实验室标本管理、生物平安和防污染策略

广西壮族自治区人民医院检验科

李友琼

;标本采集时间对扩增检测结果

的影响;标本采集部位的准备;标本的类型和采集量;采集质量的评价;采样及运输容器;标本采集中的防污染;标本运送;;容器的使用;2.RNA标本处理和保存对于RNA测定，标本

的获取、处理和方式对测定结果有决定

性影响。研究说明，用于RNA测定的血浆

标本最好是使用EDTA抗凝〔严禁使用肝素，

因其对PCR扩增有几只，且很难在核酸提

取过程中完全去除〕，抗凝后6小时内分

离血浆保存；如使用血清标本，那么需尽

快〔2小时〕别离血清后保存。保存时间

短时〔1-2周〕可放-20℃下，较长期时应

在-70℃下。;二、全血标本以全血作为

待测标本时;三、外周血单个核细胞;四、痰;2、如用于非结核杆菌如肺炎支原体的PCR检测，痰标本的处理只能室温悬浮于生理盐水中，充分震荡混匀，促使大块粘状物下沉，取上清离心，所得到的沉淀物即可用于核酸提取。

;五、棉拭子;六、脓液;

对于用于非分枝杆菌测定的脓液标本，如过于粘稠，那么参加适量生理盐水，充分振荡后，静置，取上清立即离心，沉淀用于DNA提取；如为水样，那么按上述直接离心取沉淀即可。

保存沉淀标本的保存条件同样为-70℃。;七、体液;八、组织;保存新鲜组织最好是保存于50%乙醇中，具体作法是，先用生理盐水将组织洗一次，切成宽度小于1cm的小片，参加适量的生理盐水，然后，边摇边参加无水乙醇至浓度为50%，这样固定的组织标本室温下可保存数日，4℃可保存6年。

石蜡切片用于核酸提取，需先用辛烷或二甲苯脱蜡，再用蛋白酶K消化后可进行DNA提取。;小结;;PCR污染与对策

;PCR污染与对策

;PCR污染与对策

;PCR污染与对策

;PCR污染与对策

;PCR污染与对策

;PCR污染与对策

;PCR污染原因分析

;PCR污染原因分析;

关于PCR假阳性问题;PCR假阴性问题总体来说有如下因素：

;作为参考指标，由于离心机的大小不同，有效离心半径也不相同，因此同样的转速所产生的离心力相差很大〔有的在数倍以上〕，造成PCR??阴性。这个问题在其他实验也有，但因其他实验都是测大分子蛋白沉淀，对离心的速度要求较低所以不太明显。建议使用小型台式离心机的实验要注意这个问题。;??试剂质量问题

PCR实验的成功与否试剂的质量至关重要，试剂的质量问题涉及多个方面：细胞的裂解；模板的抽提；引物位点的选择；Tap酶的活性等等。其中任一环节出了问题都会引起结果的假阴性。这些都是试剂质量的问题，因此选用高质量的PCR试剂非常重要。

;核酸模板问题;操作人员素质问题;生物平安柜的使用;II级生物平安柜

用于对人员、受试样本及环境进行保护且能满足生物平安柜危险度等级为1、2、3级的病原体操作的生物平安柜。II级生物平安柜的前窗开口区向内吸入负压气流用以保护人员的平安；经高效过滤器过滤的垂直气流用以保护受试样本的平安；排出气流经高效过滤器过滤是为了保护环境不受污染。;生物平安柜知识简介

II级生物平安柜

二级生物平安柜是目前应用最为广泛飞柜型，是有前窗操作口的平安柜，操作者可以通过前窗操作口在平安柜内进行操作，对操作过程中的人员、产品及环境进行保护。;生物平安柜的使用

与本卷须知;正确的使用生物平安柜

应遵循以下使用原那么：

缓慢移动原那么

物品平行摆放原那么

防止震动原那么

不同样品柜内移动原那么

防止明火使用原那么

定期进行平安柜防护效果的评估;

生物平安柜操作程序;一、制定操作步骤、列出明细表、准备好所有材料

二、用杀菌肥皂清洗双手、戴手套；高危险性操作

要穿隔离服，戴两副手套，手套和工作服可在

进行实验时将保护你不受到操作中生物因子的

危害，也可以防止人体所携带寄生菌对平安柜

工作区和实验样品的污染。;

三、如果紫外灯正在工作，进入实验室后关闭紫外

灯，将前窗开至工作高度病开启荧光照明灯。

确保平安柜进气和排气区域没有物体阻碍或干

扰，开启平安柜的风机进行预热5分钟，这程

序可以清楚平安柜工作区内可能经空气传播的

污染物，并有助于稳定平安柜的气流。调节工

作椅的高度，是你的肩膀和前窗下缘平行，这

样可以确保你的面部在前窗的保护之下，病有

给予你足够的操作空间。;

四、使用适当的消毒液如70%的乙醇擦拭工作区外表包

括前