高效氯氰菊酯的微核试验及精子畸形试验.docxVIP

郭爱国

一：实验材料

1.实验动物选择健康且符合相关要求的小鼠105只，体重25～30g，由贵州医科大学合作实验动物技术有限公司提供。

温度：20～25℃，湿度：40～70%RH，每日光照12h（7∶00~19∶00）。饲料贵州医科大学生物科技有限公司提供。

2.主要仪器与试剂赛多利斯电子天平（BS224S），梅特勒电子天平（PB8100-S），Olympus生物显微镜（BX51T-32E01）。以及注射器、量杯、玻璃皿、载玻片，眼科剪、擦镜纸、SPSS11.5软件等其他相关实验课配套仪器。

试剂主要有高效氯氟氰菊酯（纯度98.0%）甲醇、环磷酰胺、生理盐水、玉米油，Giemsa液，伊红染色液等。

二：实验方法

实验动物分组与剂量选择

根据GB2763-2012《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中规定的每日允许摄入量（ADI），高效氯氟氰菊酯每日允许摄入量为0.02mg/kg·BW。

将只健60只健康小鼠随机分为3组，每组20只，雌10只（5只进行小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验5只进行小鼠精子畸形试验），雄10只（5只进行小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验，5只进行小鼠精子畸形试验）。

3组分别为溶剂（玉米油）对照组，40mg/kg·BW环磷酰胺阳性对照组，0.02mg/kg·BW高效氯氟氰菊酯染毒组。

2．小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验

将受试农药用玉米油配至所需浓度，充分混匀。实验小鼠每天同一时间经口染毒1次，连续4天。各组小鼠灌胃量均为0.1ml/10g·BW，溶剂对照组经口给予等量玉米油，阳性对照组于第3、4天经腹腔注射给予环磷酰胺（40mg/kg·BW），给药量为0.1ml/10g·BW。

染毒结束次日，处死小鼠，取出小鼠胸骨骨髓于载玻片上，以1滴小牛血清混匀后推片，甲醇固定，Giemsa染色。采用双盲法，每只小鼠在油镜下观察计数1000个嗜多染红细胞（polychromaticerythrocyte,PCE），记录有微核的PCE数，计算微核率[微核率＝〔含微核的PCE数/嗜多染红细胞数〕×1000‰]。并且计数200个红细胞（redbloodcell,RBC）中PCE与正染红细胞（normochro－maticerythrocyte,NCE）的比值。

3．小鼠精子畸形试验

受试农药配制方法同上。

实验小鼠每天同一时间经口染毒1次，连续5d。各组小鼠灌胃量均为0.1ml/10g·BW。

溶剂对照组经口给予等量玉米油。阳性对照组连续5天经腹腔注射给予环磷酰胺（40mg/kg·BW），给药量为0.1ml/10g·BW。于首日染毒后第35天处死小鼠，取出两侧附睾置于盛有约2.0ml生理盐水的玻璃平皿中，用眼科剪纵向剪1～2刀，静置3～5min，轻轻摇动。用4层擦镜纸滤除组织碎片，取滤液涂片，室温干燥，甲醇固定，伊红染色。精子畸形主要表现在头部，其次为尾部。畸形类型可分为无钩，香蕉形，胖头，无定形，尾折叠，双头，双尾等。每只小鼠用高倍镜计数1000个结构完整精子，计算精子畸形率[畸形率＝〔总畸形数/1000〕×100%]。

三：统计学分析

实验数据以表示。采用SPSS11.5软件进行统计学分析。多组间比较采用方差齐性检验和单因素方差分析（One-WayANOVA）。进一步进行组间两两比较，若方差齐时，采用SNK检验（Student-NewmanKeuls法）；若方差不齐时，采用Games-Howell检验；率间比较采用χ2检验。以P0.05为差异有统计学意义。