PCR技术详解课件PPT.pptx

2021/3/101PCR技术详解PCR技术详解课件PPT全文共34页，当前为第1页。

2021/3/102一二三四五PCR简史定义基本原理反应要素PCR的类型六PCR反应流程目录八常见问题分析九PCR技术应用领域七PCR产物检测PCR技术详解课件PPT全文共34页，当前为第2页。

2021/3/103一、PCR简史1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……PCR技术详解课件PPT全文共34页，当前为第3页。

2021/3/1041985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错，未能推广1988年，Saiki等人从嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提出TaqDNA聚合酶，使得PCR技术得以广泛应用1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖PCR技术详解课件PPT全文共34页，当前为第4页。

2021/3/105二、定义

PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外高温（95℃左右）时变性成单链，低温退火（经常是60℃左右）时引物与单链按碱基互补配对原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72℃左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5’~3’)的方向延伸合成互补链

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2021/3/106三、基本原理

?PCR技术模拟DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物,该原理主要包括3个基本反应过程：模板变性———引物退火———新链延伸PCR技术详解课件PPT全文共34页，当前为第6页。

2021/3/1071234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍/v_show/id_XNjc4Mzk2Njg0.html?qq-pf-to=pcqq.c2c#pactionPCR技术详解课件PPT全文共34页，当前为第7页。

2021/3/108PCR技术详解课件PPT全文共34页，当前为第8页。

2021/3/109PCR技术详解课件PPT全文共34页，当前为第9页。

2021/3/1010理想拷贝数=2nn：循环次数实际拷贝数=(1+x)nX：平均效率,约为0.85n：循环次数PCR技术详解课件PPT全文共34页，当前为第10页。

2021/3/1011四、反应要素热稳定DNA聚合酶引物模板dNTP二价阳离子维持pH的缓冲液PCR技术详解课件PPT全文共34页，当前为第11页。

2021/3/1012热稳定DNA聚合酶目前有两种TaqDNA聚合酶供应： 天然酶：从栖热水生杆菌中提纯 基因工程酶：大肠杆菌合成一个典型的PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为100μl时）；浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。PCR技术详解课件PPT全文共34页，当前为第12页。

2021/3/10132.引物引物是PCR特异性反应的关键,PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度；引物浓度一般为0.1-0.5?mol/L，浓度过低影响产量，偏高引起错配和非特异性产物增加，且可增加引物二聚体的产生几率①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右；②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb；③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列；引物设计原则：PCR技术详解课件PPT全文共34页，当前为第13页。

2021/3/1014④避免引物内部出现二级结构：避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带；⑤引物3’端的碱基应严格要求配对：特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败；⑥引物的熔解温度（Tm值），指把DNA的双螺旋结构热变性过程中紫外吸收值达到最大值的1/2时的温度。DNA中G－C含量越高，Tm值越高，引物对之间的Tm值相差不超过2~3℃，经验公式Tm=2℃(A+T)+4℃(G+C)，引物的退火温度通常低于Tm值5~10℃；⑦引物的特异性：引物应与核酸序列