基因工程基因克隆的工具酶(共92张PPT).pptVIP

基因克隆的工具酶（instrumentalenzymeofgenecloning）:;从核酸分子的末端开始，一个核苷酸一个核苷酸地消化降解多核苷酸链，叫做核酸外切酶（exonuclease）;从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫做核酸内切酶（endonuclease）;1限制性核酸内切酶(restrictionenzyme);一类能从DNA分子中间水解磷酸二酯键,从而切断双链DNA的核酸水解酶。它们不同于一般的脱氧核糖核酸酶（DNase），它们的切点大多很严格，要求专一的核苷酸顺序─识别顺序。;1.1寄主控制与修饰现象(Restrictionandmodification);在Ecoli.K上生长的λ噬体则表示为λ（K）。

实验表明，用这种λ（K）噬菌体感染Ecoli.B，形成噬菌斑的效率就很低

因此λ（K）噬菌体受到了B菌体的限制。;Modification,DNAmethylation,isthemechanismbywhichthehostbacteriaprotectsitsownDNAfromcleavagebytherestrictionendonuclease.

AmodificationmethyltransferasemethylatestheDNAatthesamerecognitionsequencethattherestrictionendonucleaseusestobindtotheDNApriortocleavage.

ThisactivitydiscriminatesselfDNAfromforeignDNA.?;Invivorestrictionofbacteriophagelambdabytwodifferentrestrictionsystems.?;1.2限制性内切酶的种类;不兼有甲基化酶的活性，细胞内另有独立的甲基化酶。

它切断DNA时不需ATP，也不需SAM。

它的切点是严格的，而且就在识别顺序之中。;1.3限制性核酸内切酶的命名;EcoRⅠEscherichiacoli（大肠杆菌）RY13之酶Ⅰ

HindⅢHaemophiliusinfluenzae（嗜血流感杆菌）Rd之酶Ⅲ

AluⅠArthrobacterluteus（藤黄节杆菌）之酶Ⅰ

HaeⅢHaemophilusaegyptius（埃及嗜血菌）之酶Ⅲ;?在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子产生链的断裂;识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列;EcoRI等产生的5′粘性末端;Cleavagesites

PvuII等产生的平头末端

DNA连接酶的反应条件

研究超盘旋DNA分子的二级结构，并改变因诱变剂处理所出现的双链DNA的螺旋结构

分子生物学研究工作中经常使用的DNA聚合酶

Thetwoplatesattherightshowasignificantreductioninthenumberofplaquesduetorestrictionactivity.

特异水解断裂DNA分子的则叫做脱氧核糖核酸酶（DNase）

TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1978

大肠杆菌中的dcm甲??化酶在5′CCAGG3′或5′CCTGG3′序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoRII等哺乳动物中的甲基化酶在5′CG3′序列中的C5位上引入甲基

1核酸外切酶VII（ExoVII）

1末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase，TdT）

G------CTTAA5′

碱性磷酸酶的这种功能，对于DNA分子克隆是很有用的。

因此λ（K）噬菌体受到了B菌体的限制。

限制性核酸酶在原核和真核细胞中都有发现

有一部分核酸内切限制酶对于钠离子或钾离子浓度变化反应十分敏感;PvuII等产生的平头末端;1.5同裂酶和同尾酶;Sau3AⅠ和BamHⅠ同尾酶所形成的杂种位点对Sau3AⅠ敏感，但不是BamHⅠ的识别位点识别;1.6限制片段末端的连接作用;由同一片段的2个互补末端之间的碱基配对而形成的环形分子。;1.7大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件;1.8影响核酸内切限制酶活性的因素;②DNA样品的甲基化程度;③酶切消化反应温度;④DNA的分子结构;⑤核酸内切限制酶的缓冲液;缓冲液Tris-HCl的作用在于使反应混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳数值