固定化酶与固定化细胞.pptVIP

精品医学ppt(3)交联法利用双功能或多功能试剂在酶分子间、或酶分子与惰性蛋白间进行交联反应以制备固定化酶的方法。常用的试剂有戊二醛、甲苯二异氰酸酯、乙烯-马来酸酐共聚物等。交联法操作简便，但交联反应往往比较激烈，许多酶容易在固定化过程中失活，酶回收率不高。交联法发生作用的氨基酸残基：酪氨酸的酚基胱氨酸的SH巯基N－末端的a－氨基常用的双功能或多功能试剂：戊二醛聚甲叉双碘乙酰胺双重氮联苯胺共价交联法的四种形式1）酶直接交联法在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖于酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。操作简单，但是缺乏选择性，活力回收往往不高。2）酶辅助蛋白交联：当可得到的酶量有限，可以使用第二个“载体”蛋白来增加蛋白质浓度，从而使酶与惰性蛋白共交联的方法。这种“载体”蛋白即辅助蛋白，可以是白蛋白、明胶、血红蛋白等。3）吸附交联法：此法先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联，用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。4）载体交联法：用多功能试剂的一部分功能基团化学修饰高聚物载体，而其中的另一部分功能基团偶联酶蛋白。(4)包埋法通过物理或化学的方法将酶或细胞限制在一定的空间范围内，底物和产物能自由扩散，从而达到重复利用生物质的一种固定化方法。此方法是固定化细胞的最主要方法。包埋法可分为格型包埋和微囊型包埋。前者是将酶或细胞分散包埋在聚合物的胶格中，如聚丙烯酰胺凝胶、卡拉胶、聚乙烯醇、海藻酸钙等；后者是将一定量的酶或细胞包在半透膜内，如尼龙膜、醋酸纤维、NaCS/PDMDAAC胶囊等。此法制备条件温和、生物相容性好，但仅可用于低分子量的底物，且常受扩散限制。微胶囊特点微囊直径几微米～几百微米。低分子底物可以自由通过并进入微囊内。酶本身是高分子物质不能通过微囊而被留在微囊中，外部的蛋白分解酶、抗体等高分子物质也无法进入微囊内包埋法的优点在于它是一种反应条件温和、很少改变酶结构但是又较牢固的固定化方法。包埋法的缺点是只有小分子底物和产物可以通过高聚物网架扩散，对那些底物和产物是大分子的酶并不适合。这是由于高聚物网架会对大分子物质产生扩散阻力导致固定化酶动力学行为改变，使活力降低。包埋法的优点、缺点微囊化制备方法微囊法主要将酶封装在胶囊、脂质体和中空纤维中。胶囊和脂质体主要用于医学治疗，中空纤维主要适于工业使用。微囊制备方法（1）界面沉淀法是一种简单的物理微囊化法，它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。（2）界面聚合法有机溶液中添加表面活性剂使之乳化形成油包水结构,再用单体分子在界面聚合,达到包埋目的的一种方法。（3）原位聚合没有界面发生的聚合反应成膜A乳化分散：取含有酶和亲水性单体的水溶液，在不溶于水的有机溶媒中充分乳化。B表面聚合：将含有疏水性单体的有机溶媒加入到上述乳化液中，发生聚合反应，生成的薄膜把酶包围起来形成微型胶囊球。C清洗：反应完成后，用有机溶剂洗去未反应的剩余单体1界面聚合法微胶囊的制备（example)-原位聚合NaCS(SodiumCelluloseSulphate）纤维素硫酸钠PDMDAAC(PolydimethyldiallylammoniumChloride，聚二甲基二烯丙基氯化铵这两种物质均是能溶于水的聚电解质。NaCS是聚阴离子化合物，PDMDAAC为聚阳离子化合物，当这两种带不同电荷的物质混合时，在两者的界面发生络合反应，生成多聚电解质复合体（PEG，PolyelectrolyteComplexe，形成了一层半透膜。NaCS-PDMDAAC微胶囊制备的反应过程示意图固定化酶的制法及其特性比较特性制备方法共价键结合法离子结合法物理吸附法包埋法制法难易易难酶活力高高高低底物特异性易变不变不变不变结合能力强中弱弱再生不可可能可能不可交联法难中易变强不可固定化酶的保存方法使用时固定化酶的保存是一个很重要的环节。1真空冷冻干燥保存（长期保存）2低温保存3