基因工程制药工艺.pptVIP

培养工艺与控制目的:提供生长和产物合成的适宜条件,使菌种发挥最大的遗传潜力考虑工艺条件对工程菌生长、产物生物合成及质粒稳定性的影响基因工程制药发酵控制培养工艺与控制质粒的不稳定性与控制策略温度溶解氧pH基因工程制药发酵控制基因工程制药发酵控制质粒复制不稳定性：不正常的起始和终止、延伸时断裂及错配等，产生单链质粒和高分子量畸型质粒。质粒分配不稳定性：细胞分裂时，质粒也分配，在子代细胞中分配不均一而导致部分细胞完全丢失质粒。子细胞中质粒拷贝数质粒结构不稳定性：由于缺失、插入、突变或重排等使质粒DNA的序列结构发生了变化，引起复制和表达的不稳定性。工程菌的质粒不稳定性基因工程制药发酵控制基因工程菌质粒稳定性受宿主细胞的特性、质粒的类型和培养条件等影响，是质粒、宿主菌与培养环境三者之间相互作用的结果。对于一定结构质粒，筛选适宜宿主菌，优化培养条件与工艺，提高稳定性，对基因工程药物的生产具有重要的意义。提高质粒稳定性的策略温度对工程菌生长的影响符合三基点原则：最低，最适，最高大肠杆菌和酿酒酵母生长最低温度10℃大肠杆菌生长最适温度37℃，最高温度45℃酿酒酵母生长最适温度30℃，最高温度40℃基因工程制药发酵控制温度对工程菌产物合成的影响生长与生产温度不一致。工程大肠杆菌：较高温度表达量大，易形成包涵体。较低温度有利于表达可溶性蛋白质。对于热敏感的蛋白质，高温会降解破坏。基因工程制药发酵控制温度对工程菌质粒稳定性的影响随着温度升高，质粒的稳定性下降。大肠杆菌在30度左右质粒稳定性好。采用温敏启动子控制的质粒，大肠杆菌由30度升高到42度诱导外源基因表达目标产物时，经常伴随质粒的丢失。基因工程制药发酵控制两段变温发酵培养：前期：较高温度发酵，有利于生长，获得高密度菌体；后期：较低温培养发酵，对菌体合成目标产物的抑制不明显，但可有效抑制目标产物的降解和包涵体形成，总体提高工程菌的生产能力。温度控制基因工程制药发酵控制温度诱导型大肠杆菌表达系统：可建立基于温度变化的分步连续培养，在第一个反应器中，30-37℃下生长培养，增加质粒稳定性，然后流入第二个反应器中，在42℃下诱导表达。温度的控制相当重要，必须选择适当的诱导时期和适宜的诱导温度。温度控制基因工程制药发酵控制pH值对发酵的影响细菌喜欢偏碱性：大肠杆菌适宜pH为6.5-7.5真菌喜欢微酸性：酵母适宜pH为5.0-6.0影响产物稳定性，最适生长和最适生产pH不同。乙酸是微生物代谢的副产物，使菌体生长速率下降，也抑制基因表达。基因工程制药发酵控制pH值对质粒稳定性的影响干扰素在酸性条件下稳定，而在碱性条件下容易降解。酸性环境有利于发挥工程菌株生产能力。酵母生产重组表达乙肝表面抗原的质粒在pH6时最稳定，在pH5时质粒最不稳定。基因工程制药发酵控制研究发酵过程中各个阶段的适宜pH，通过流加、补料、搅拌等措施，设法控制pH在合适的范围内。分阶段控制pH：根据试验结果来确定生长最适pH和产物最适pH，以达到最佳生产。pH值控制基因工程制药发酵控制工程菌是好氧微生物，生长过程需要大量氧。从供氧量和需氧量（菌体生长、质粒稳定性、产物积累）二个方面考虑，使之需氧不超过设备的供氧能力，在临界溶解氧浓度之上。考虑高氧浓度对产物的氧化降解作用，低氧或厌氧导致有机酸生成，抑制生长。调节搅拌转速和通气量，级联控制溶解氧控制基因工程制药发酵控制较低生长速率下质粒稳定,提高氧压力或增加氧浓度能引起细胞内氧化性胁迫，稳定阶段缺氧条件引起产物生成和质粒稳定性受限制。搅拌强度明显影响质粒丢失速率，质粒稳定性都随搅拌强度提高而下降，温和的搅拌速率适于保持质粒的稳定性。溶解氧控制基因工程制药发酵控制基因工程制药发酵控制连续无选择压力培养，质粒稳定性随稀释速率的增加而降低，如果再加入选择剂，又可提高质粒的稳定性。在恒化器中无选择剂下培养时，开始一段时间质粒丢失很快，然后就维持一定水平。连续操作对质粒稳定性的影响基因工程制药发酵控制定期分批流加时质粒稳定性比间歇培养和恒化器培养高。随着培养时间延长，质粒稳定性下降。适宜的流加方式有利于提高质粒在非选择性培养基中的稳定性。携有质粒的细胞在对数生长期减少，在静止期又增加，在底物耗尽时，无质粒细胞死亡也较快。改恒速流加为变速流加，能提高非选择条件下质粒稳定性。流加操作对工程菌质粒稳定性的影响筛选策略与方法基于载体抗生素抗性基因，抗生素筛选法：被Bla基因编码产物b-内酰胺酶分泌到培养基水解。在抗性大菌落的周围形成小卫星菌落：为什么？基因工程制药工程菌构建氨苄青霉素质粒中lacZ标