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中国现代药物应用2010年11月第4卷第21期ChinJModDrugAppl，Nov2010，Vo1．4，No．21·8l·

一种经济便捷的手足口病原RNA提取方法

张畅斌尹爱华何天文王波邓文喻赖有行

【摘要】目的介绍运用二氧化硅微粒经济便捷提取手足口病原RNA的方法。方法手足口病

患儿临床标本107份(粪便89份，肛拭18份)分别以二氧化硅微粒法及QIAGEN试剂盒提取RNA，以实

时荧光RT．PCR检测肠道病毒通用型、肠道病毒71型(EV71)及柯萨奇病毒A组l6型(CoxA16)特异核

酸片段。结果88份(98．9％)粪便标本，17份肛拭(94．4％)肛拭标本运用二氧化硅微粒法提取的

RNA在手足口病原实时荧光RT。PCR检测中取得与QIAGEN试剂盒相一致的结果。结论二氧化硅微

粒法提取手足口病原RNA经济、便捷、有效，适合临床实验室应用于手足口病的诊断。

【关键词】手足口病；肠道病毒；核酸提取；RT—PCR；实时荧光RT—PCR

手足口病是由肠道病毒(enterovirus)引起的急性传染1．4．1二氧化硅微粒法

病，其中以柯萨奇病毒A组l6型(CoxA16)、肠道病毒71型1．4．1．1加适量0．9％氯化钠注射液(粪便标本：20倍体

(EV71)多见。近年该病在我国部分地区活跃流行并有死亡积；肛拭标本：1m]／拭子)震荡，悬液5000×g离心1min，吸

病例报告…，引起医疗卫生工作者的关注。实时荧光RT—上清100l于一个新管。

PCR¨2由于具有快速而敏感的特点，成为临床实验室诊断手1．4．1．2加入200Ixl裂解液，震荡混匀

足口病常用手段。实时荧光RT．PCR要求从标本中提取一1．4．1．3加入10LL1二氧化硅微粒悬液(注意吸取时确保悬

定浓度和纯度的病原RNA作为反应材料，目前较为普遍的液悬匀状态)，震荡15s。

是使用各种商品试剂盒提取RNA。各种商品试剂盒提取1．4．1．46000×g离心(转速达6000×g后开始计时)10s，

RNA具有成本高、步骤繁琐的共同缺点。为了合理利用医疗弃上清，留沉淀

资源，提高效率，有必要寻找一个较为经济便捷，效果接近商1．4．1．5加入200l裂解液，震荡混匀，6000g离心(转

品试剂盒的病毒RNA提取方法。BOOM等报道的二氧化速达6000g后开始计时)10s，弃上清，留沉淀。

硅微粒提取核酸方法成本低廉、操作方便，对仪器设施要求1．4．1．6加入400l洗涤液，震荡混匀，如沉淀不能分散，

不高，是较有希望的候选方法。我们根据手足口病原的特点必须用移液器吸头吹打至悬匀。

对该法作进一步优化精简，并通过对比实验证明，该法与1．4．1．76000×g离心(转子速度达6000g后开始计时)

QIAGEN试剂盒所提取的RNA，在手足口病原实时RT-PCR10s，弃上清，敞开管盖，60℃加热5min，挥发干残留乙醇。

检测中，效果接近。下面作详细介绍。1．4．1．8加入30l预热至70℃的DEPC水，震荡混匀，如

1材料与方法沉淀不能分散，应该用移液器吸头吹打至悬匀，瞬时离心5s，

1．1标本来源2010年6月本院门诊及住院临床诊断为手上清液用于实时荧光RT—PCR检测。

足口病患儿发病7d内的粪便标本89份(年龄5个月一71．4．2使用QIAmpVimlRNAMiniKit严格按说明书操

岁，男50：女39)，肛拭标本18份(年龄8个月一5岁，男：女作。在最后RNA洗出步骤时用421,zLAVE溶液过两次柱子，

=11：7)。收集RNA洗出液，直接用于实时荧光RT-PCR检测。

1．2主要仪器RocheLightCycler480荧光定量PCR仪。