细胞因子的ELISA方法检测.pdf

细胞因子的方法检测实验日期

院系医学院专业医检班级

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一、实验目的

掌握法的基本步骤和原理。

二、实验器材

试剂：

酶标抗体、底物A、底物B、终止液、2000pg/mlPGFpl标准品、待测标本1、待测标本2

器材：

酶标架、己包被抗体的酶标条、封口膜、洗涤液、微量加样枪、酶标仪

三、实验原理

1.细胞因子测定的3类主要方法：

1生物学方法：测细胞因子具有的生物学活性；代表实际活性，方法繁复、其它细胞因子

干扰。

2）免疫学方法：细胞因子作为抗原被测定浓度；简便灵敏，不等于实际活性。

3）分子生物学方法：测细胞因子mRNA水平，间接反映浓度；较简便更灵敏，不等于实际

活性和浓度。

2.三类方法各有优缺点：

以免疫学方法较为简便和常用。免疫学方法有酶联免疫吸附测定法（ELISA）放射免疫测定法

RIA）等，而酶联免疫斑点法（ELISPOT）则可用于检测单个细胞的细胞因子产生情况。

（

3.酶联免疫吸附剂测定（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）的基本原理是：

——双抗夹心法

1）包被：将细胞因子抗体吸附在酶标板表面，形成固相抗体。

2）用封闭液中的蛋白如牛血清白蛋白封闭酶标板表面剩余的吸附位点。以避免对后续测定

中抗原抗体的非特异性吸附。

3）加入被测标本进行孵育，则其中的被测细胞因子就与固相上的抗体发生特异性结合，不

发生结合的其他成分可通过洗涤去除。

4）加入辣根过氧化物酶HRP标记的抗细胞因子抗体进行孵育，则酶标抗体也与细胞因子发

生特异性结合。被结合的酶标抗体的数量与细胞因子的浓度成正比。

5）洗涤去除多余的酶标抗体，再加入酶催化的底物，在酶的催化下，底物形成有色产物。

6）作用一定时间后，终止酶促反应。测定产物颜色，可以反应酶浓度高低，间接反映被测

细胞因子的浓度。通过已知标准样品的对照，就可以推算出待测细胞因子的浓度。

2条，分别装于酶标架上。在每条酶标条的16孔分别

加入稀释液100微升。

2.向第6、7孔加入分别加入2000pg/mlPG邱1标准品100微升。

3.用加样枪吹吸混匀第6孔的液体，注意避免气泡形成。混匀后其浓度约为1000pg/ml。

4.再吸出100微升加入第5孔，吹吸混匀。其浓度变为500pg/ml。以此类推，一直加到第2

孔。吸去多余的100微升。

5.向第8、9孔各加入100微升样品1。10、11孔加入100微升样品2.

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6.封口膜覆盖酶标板，防止水分挥发。

7.将酶标板置于37°C温箱孵育120mino

8.取出孵育后的酶标板，揭开封口膜，甩去孔中液体，注意甩动方向，避免液体流入相邻酶

标孔，造成交叉污染。

9.加入洗涤液，注意不要溢出至相邻孔，造成交叉污染。静置3min后甩去孔中液体，重复

以上洗涤过程4次。在吸水纸上拍干孔中液体。

10.每个孔各加入酶标记抗体100微升。封口膜覆盖酶标板，将酶标板置于37°C温箱孵育

60mino

11.取出孵育后的酶标板，揭开封口膜，甩去孔中液体。再加入洗涤液，静置3min后，甩

去孔中液体，重复以上洗涤过程4次。在吸水纸上