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几种常用的细菌染色法
目录/Contents1简单染色法革兰氏染色法芽孢染色法染色2345荚膜染色法鞭毛染色法
01简单染色法常用碱性染料进行简单染色原理在中性、碱性或弱碱性溶液中,细菌细胞通常带负电荷,而碱性染料在电离时,其分子的染色部分带正电荷(酸性染料电离时,其分子的染色部分带正电荷),因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色,经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比,在显微镜下易于识别。常用作简单染色的染料有:美蓝、结晶紫、碱性复红等。
01简单染色法1.简单染色法步骤:
01简单染色法(1)涂片取干净的载玻片一块,滴一小滴生理盐水于载玻片中央,严格按无菌操作程序,挑取大肠杆菌或金黄色葡萄球菌于载玻片的水滴中,调匀并涂成薄膜。
01简单染色法(2)晾干让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方以文火烘干。(3)固定手执玻片一端,让菌膜朝上,通过火焰2~3次固定(以不烫手为宜)。(4)染色将固定过的涂片放在搁架上,加复红或结晶紫染色1~2min。(5)水洗染色时间到后,用自来水冲洗,直至冲下之水无色时为止。注意冲洗水流不宜过急,过大,水由玻片上端流下,避免直接冲在涂片处。(6)干燥将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。(7)镜检先低倍镜观察,再高倍镜观察,并找出适当的视野后,将高倍镜转出,在涂片上加香柏油一滴,将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。
02革兰氏染色法革兰氏染色步骤:涂片→干燥→固定→结晶紫染色→水洗→吸干→95%酒精脱色→水洗→吸干→蕃红复染→水洗→干燥→镜检。(1)涂片涂片方法与简单染色涂片相同。(2)晾干与简单染色法相同。(3)固定与简单染色法相同(4)结晶紫染色将玻片置于玻片搁架上,加适量(以盖满细菌涂面)的结晶紫染色液染色1min。
02革兰氏染色法(5)水洗倾去染色液,用水小心地冲洗。(6)媒染滴加革兰氏碘液,媒染1min。(7)水洗用水洗去碘液。(8)脱色将玻片倾斜,连续滴加95%乙醇脱色20~30s至流出液无色,立即水洗。(9)复染滴加蕃红复染1~2min。
02革兰氏染色法(10)水洗用水洗去涂片上的蕃红染色液。(11)晾干将染好的涂片放空气中晾干或用吸水纸吸干。(12)镜检镜检时先用低倍镜,再用高倍镜,最后用油镜观察,并判断菌体的革兰氏染色反应性。革兰氏阴性菌呈红色,革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准,过于密集的细菌,常常呈假阳性。
03芽胞染色法芽孢染色步骤:涂片→固定→孔雀绿染色→水洗→干燥→观察。(1)将有芽胞的材料作涂片、干燥、固定。(2)将5%孔雀绿水溶液滴加于固定好的涂片上。用木夹夹住载玻片在酒精灯火焰上加热,使染料冒蒸汽(但不能煮沸),切勿使染料蒸干,必要时可添加少许染料。加热时间从冒蒸汽时开始计算约4~5min。
03芽胞染色法芽孢染色步骤:涂片→固定→孔雀绿染色→水洗→干燥→观察。(3)倾去染色液,待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再退色为止。(4)用0.5%沙黄水溶液复染1min,水洗。(5)干燥或烘干后,置油镜观察,芽胞呈绿色,菌体呈红色。
04荚膜染色法荚膜染色液:绘图墨水,1%甲基紫水溶液,1%结晶紫水溶液,6%葡萄糖水溶液,20%硫酸铜水溶液,纯甲醇等。(1)湿墨水法①制备菌和墨水混合液加一滴水于洁净的载玻片上,然后挑取少量菌体与其混合均匀。
04荚膜染色法荚膜染色液:绘图墨水,1%甲基紫水溶液,1%结晶紫水溶液,6%葡萄糖水溶液,20%硫酸铜水溶液,纯甲醇等。②加盖玻片将一洁净的盖玻片盖在混合液上,然后在盖玻片上放一张滤纸,轻轻按压以吸去多余的混合液。③镜检用低倍镜和高倍镜观察,若用相差显微镜观察,效果更好。背景灰色,菌体较暗,在菌体周围呈现明亮的透明圈即为荚膜。
05鞭毛染色法(1)硝酸银染色法①菌种的准备要求用活跃生长期菌种作鞭毛染色。对于冰箱保存的菌种,通常要连续移种1-2次。良好的培养物,是鞭毛染色成功的基本条件,不宜用已形成芽孢或衰亡期培养物作鞭毛染色的菌种材料,因为老龄细菌鞭毛容易脱落。②载玻片的准备将载玻片在含适量洗衣粉的水中煮约20min,取出用清水充分洗净,沥干后置95%乙醇中,用时取出在火焰上烧去酒精及可能残留的油迹。
05鞭毛染色法7.鞭毛染色法(1)硝酸银染色法③菌液的制备取斜面或平板菌种培养物数环于盛有1~2mL无菌水的试管中,制成轻度混浊的菌悬液用于制片。也可用培养物直接制片,但效果往往不如先制备菌液。④制片取一滴菌液于载玻片上的一端,然后将玻片倾斜,使菌液缓缓流向另一端,用吸水纸吸去玻片下端多余菌液,室温(或37℃)自然干燥。
05鞭毛染色法7.鞭
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