溶胶-凝胶法固定α-淀粉酶及其活性和包埋量测定.docVIP

溶胶-凝胶法固定α-淀粉酶及其活性和包埋量测定

摘要:采用溶胶-凝胶材料正硅酸乙酯为硅原对α-淀粉酶进行包埋固定，研究包埋后酶

的使用性能，结果表明包埋后可使酶的抗变性能得到提高。

关键字：溶胶-凝胶材料正硅酸乙酯；a-淀粉酶；干的含酶凝胶；牛血清蛋白；考马斯亮蓝

酶工程的固定化技术核心包括固定化方法和固定化载体。固定化方法主要有物理包埋法、吸附法和共价交联法等。其中，物理包埋法具有实验条件温和、对生物活性单元失活作用小、不易泄漏及可固定高浓度的生物活性单元等优点，是迄今应用最为普遍的固定化技术。载体材料的物理和化学性质决定着固定化生物活性单元活力的大小。

本实验采用溶胶-凝胶材料正硅酸乙酯为硅原对α-淀粉酶进行包埋固定，研究包埋后酶的使用性能。溶胶-凝胶是一种起源于约150年前的生产陶瓷材料的方法,它受到青睐是因为它提供了一种方便的途径来固定那些对热敏感的化学和生物分子.溶胶-凝胶过程包括两个步骤,一是烷氧基金属有机化合物(如Si(OC2H5)4,Ti(OC2H5)4等)的水解过程;二是水解后得到的羟基化合物的缩合及缩聚过程.如下：

淀粉遇碘显蓝色，且淀粉有杀死酶的作用。不同量的淀粉和一定量的碘所显的颜色深浅不同，这就提供了一条测溶液中淀粉含量的方法－可见分光光度法，以一系列的不同量的淀粉溶液做一条淀粉量与吸光度的标准曲线，再测定未知溶液的吸光度，从而可以求出未知淀粉溶液中淀粉的量。通过测定与固定化酶颗粒反应后的淀粉的量，就可以求的水解的淀粉量从而计算出固定化酶的活性。

1实验

1．1主要试剂与仪器

正硅酸乙酯HAca-淀粉酶Tris-HCl(PH=7.58)缓冲溶液0.01N的碘考马斯亮蓝G-250牛血清蛋白可见分光光度计

1.2溶胶-凝胶法固定a-淀粉酶

1.量取12.9ml正硅酸乙酯于一50ml的锥形瓶中，加入1.34ml的蒸馏水，搅拌5min后入0.09ml的HAc继续搅拌直到溶液透明。

2.称取0.4ga-淀粉酶于10ml的比色管中,并用Tris-HCl(PH=7.58)缓冲溶液定容于10ml,摇匀后在4℃冷藏、静置。

3.当1中的溶液透明后，取5ml的2的上层溶液加入到1中,继续搅拌直到凝胶出现。

4.固定好的凝胶在低温下干燥约一周后破碎，测其酶含量及其活性。

1.3淀粉酶作底物法测酶的活性

1.3.1淀粉工作曲线的制作

1）配制0.4mg/ml的可溶性淀粉

2）配制0.01N的碘应用液

3）按下表取体积量，制作淀粉工作曲线，以水作参比,以水作空白，测定各管660nm下的吸光值，以吸光值为纵坐标，淀粉体积为横坐标做图，得到标准曲线。

1.3.2淀粉酶作底物法测酶的活性

1）称取干的含酶凝胶0.100g，溶于10ml比色管中,加入0.5ml4mg/ml淀粉溶液，反应5min,用Tris-HCl(PH=7.58)缓冲溶液定容到5ml。

取0.3ml的上清液于一比色管中，进行淀粉浓度测定。

3)从标准曲线上算出消耗的淀粉量。

1.4牛血清蛋白标准曲线的制作

1）考马斯亮蓝G-250的配制：称取25mg考马斯亮蓝G-250溶于12.5ml95%乙醇中，

加入49g85%磷酸后加水至250ml,置于一塑胶瓶中，冰箱内保存。

2）配制0.1mg/ml的牛血清蛋白溶液。

3）工作曲线的制作：取8支比色管，按表加入试剂混匀后静置2min，以1号管作空白对比，在1h内测定各管595nm下的吸光值，以吸光值为纵坐标，蛋白浓度为横坐标作图，得到标准曲线。

1.5考马斯亮蓝法测a-淀粉酶的含量

取0.05ml0.04g/ml粗a-淀粉酶溶液按工作曲线测定吸光度，带入工作曲线计算出所配粗酶实际浓度：ug/ml

2结果与讨论

2.1淀粉标准曲线数据记录表

1

2

3

4

5

6

7

8

I2/ml

1.5

1.5

1.5

1.5

1.5

1.5

1.5

1.5

淀粉/ml

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

水/ml

5

5

5

5

5

5

5

5

660nm

0

0.103

0.223

0.306

0.379

0.431

0.481

0.538

测得干的含酶凝胶的淀粉溶液吸光度为0.102代入所得直线方程y=0.7563x+0.0429得淀粉剩余量为x=0.07814ml

故酶的活性=（0.3-0.07814）/0.3*100%=73.95%

2.2蛋白标准曲线记录表

1

2

3

4

5