和康无创产前检测nipt技术原理.pptx

无创产前检测（NIPT）技术原理主讲人：田洪润北京贝瑞和康医疗器械有限公司

胎儿游离DNA（cffDNA）胎儿游离DNA：cell-freefetalDNA（cffDNA）Fetalcf-DNAdetectedviaYchromosomeLoYMetal.,Lancet1997·母体外周血含有的cffDNA，几乎全部来源于胎盘滋养细胞·怀孕4周可检出，8周后含量上升并稳定存在。（7周建立胎儿胎盘循环）·cffDNA片段比较小，长度在75bp和250bp之间，平均仅为166bp·母体外周血中的cffDNA含量在5%-30%之间。孕周越大外周血中胚胎DNA的含量越高·游离的胎儿DNA可被从母体血浆中迅速清除,平均半衰期仅为16.3min(4~30min)。大多数孕妇在产后2h血浆游离胎儿DNA已测不到

无创产前检测技术（Non-invasiveprenataltesting）抽取外周血血浆分离DNA提取文库制备qPCR定量测序生物信息分析

1、血浆分离10ml全血两步离心，两次转管，获得血浆1、4℃，1600g离心10min，转移血浆每支1.4ml2、室温，16000g离心10min，转移上清每支1.3ml每支1.3ml血浆

2、DNA提取血浆游离DNA提取试剂盒ReagentⅡ（核酸助沉剂）磁 珠（与DNA特异性结合）ReagentⅠ（水解核酸蛋白）Lysisbuffer（蛋白变性剂）

3、文库制备（EZ-PALO快速建库方法）purification补平加A加接头胎儿染色体非整倍体（T13/T18/T21)检测试剂盒

纯化过程磁珠 结合DNA吸附弃废液 冲洗表面 洗脱转移测序文库构建DNA纯化试剂盒

最适合临床应用的超简建库法降低临床操作复杂度降低出错的可能性25MIN纯化40MIN2步加样，1步纯化，全程3小时降低污染质控更容易补平加A加接头PCR-FREE

4、qPCR定量 所谓定量PCR技术（简称qPCR），是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

QC试剂货号、品名（中英文）、货物描述货号包装规格厂家信息KAPASYBR?FASTUniversal2XqPCRMasterMix(5mL)KK4601盒（5ml/盒）kapabiosystemsDNAQuantificationStandardsandPrimerPremixKit/IlluminaGAKK4808盒（480ul/盒）kapabiosystems

SYBRGreen法

数量关系 每形成一条DNA双链，就有一定数量的染料结合上去 染料一结合，就产生荧光信号 信号强度与DNA分子总数目成正比

熔解曲线 Tm值：50%双链DNA变成单链时的温度，此温度与DNA的长度、GC含量有关，可部分代表序列的特异性 PCR过程中，控制温度缓慢升高，双链DNA解链成为单链DNA，SYBRGreen被释放，

QC结果判定qPCR数据可用(R2≥0.99;slope在-3.6—-3.1之间，efficiency在90%-110%)CT=-klgX0+b

溶解峰

QC结果判定标准曲线的判定：0.99,reactionefficiency：90%-110%R2≥ -3.6slope-3.1,NTC无扩增溶解峰判定：宽峰、双峰、dimmer峰（Tm81）均不合格正常峰为单峰，Tm值为77-81浓度的计算与判定：?浓度=452/文库片段大小*qPCR读数*

5、测序

测序文库的构成

Flowcell构成Highoutput:Lanes:4Surfaces:2Swathsperlane:3Camerasegments:3Tiles:12Totaltiles:864

NextSeq CN500的Flow Cell接头

DNA片段杂交TemplateHybridization模板杂交UUInitialextension第一链的延伸UUDenaturation变性UU

碱基片段扩增成簇 Cluster1stcycleannealing退火UU1stcycleextension延长UU2ndcycledenaturation再变性UU2ndcycleannealing退火UUU2ndcycleextension延长UUUn=35total

簇生成与测序P5Linearization(USER)线性化BlockwithddNTPs阻断Read1Primer加Read1测序引物SequencingFirstRead第一端测序Sequencing