(1.4)--实时PCR定量分析.ppt

目录题的描述模型的建立模型的结果模型的应用

1.问题的描述聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction,PCR）是一个在体外快速复制特定的DNA片段的过程，这项技术使人们很快从试管中获得大量拷贝的特异核酸片段。

PCR基本原理在DNA聚合酶的作用下，通过控制反应液的温度，实现对模板DNA的扩增，一个DNA片段的聚合酶链式反应由25-40个循环组成。变性94~96℃退火45~55℃延伸72℃左右

图1PCR反应过程详解

荧光PCR原理反应中，加入引物的同时，加入特异性的荧光探针；退火时，引物与探针同时与模板结合，并发出荧光信号。每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成，因此荧光的总量可以代表PCR扩增产物的数量。图2荧光探针示意图

第n个循环周期的荧光值为：缺点：2.函数非收敛。1.扩增效率是常数；基于阈值的标准曲线法

实验结果取培养好的大肠杆菌，样品在40个循环数的荧光值见表1。循环数荧光值循环数荧光值循环数荧光值循环数荧光值151311908212572.73111881128.112908.7223281.632134562.2349.313978.6234074.433147129.24272.4141009.1245888.434157762.75284.9151118.6259944.735166673.46192161245336174413.97289.9171436737181007.88621.6181664138187059.49925.9191793139192241.310949.4202172540196447.5表1大肠杆菌40个循环数的荧光值

研究的问题分析扩增效率0402建立数学模型01确定参数模型的精确度和稳定性03

2.模型的建立理论上，符合有限增长的微分方程模型。循环数荧光值图3荧光值散点图实验显示，散点图大致呈“S”型，见右图；

2.1Logistic模型求解初值问题，得到方程的解。可以得到微分方程模型：

Logistic函数：Logistic函数可以化简为：

2.2Richards模型

校正后的Richards模型校正后的Logistic模型2.3校正模型简化模型(1)和Richards模型拟合的结果与实验值总是存在一个偏差，因此需要对模型进行校正。

因此，第n个循环数的实际荧光值是第n个循环数的扩增效率是

最小二乘法0102032.3确定参数总离差平方和：求驻点：MATLAB统计工具箱中的nlinfit命令。

3.模型的求解输出：循环数向量n;荧光值向量F;MATLAB的统计工具箱nlinfit命令各参数的初始值：误差条形图。回归曲线；均方根误差：RSED；决定系数R2；各参数95%的置信区间；各参数的值；输入：36组数据用做训练，4组数据用来验证

结果分析决定系数R2均大于0.99，说明回归方程具有很好的拟合优度。Richards回归方程的R2大于Logistic回归方程，均方根误差小于Logistic回归方程。Richards模型精确度优于Logistic模型。模型参数估计95%的置信区间下限上限LogisticM1.905*1051.854*1051.956*105a2.1841.9982.371R2=0.9978c30.0729.8630.29RMSE:3447Fb-126.3ichardsM1.977*1051.931*1052.023*105a3.1372.7433.531R2=0.9994c24.2120.0328.39RMSE:1869d5-0.0269810.27Fb90254.861749表2Logistic模型和Richards模型的输出结果

验证结果用验证组的数据分别对两个模型进行验证，结果表明：（1）Richards模型的精确度高于Logistic模型；（2）每个模型测试组的RMSE与验证组的RMSE相差不多，说明两个模型均不存在过拟合。循环数实验值Logistic预测值Richards预测值141009.1-4.946902.0142618328.325455.8321948.6832134562.2134669228187059.41854572RMSE3688.08319