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抗犬细小病毒VP2蛋白单链抗体的制备与中和活性研究
汇报人：
2024-02-05
引言
实验材料与方法
VP2蛋白单链抗体的制备
中和活性研究
结果与讨论
结论与展望
01
引言
犬细小病毒（CanineParvovi…
犬类常见的高度传染性疾病，对犬类健康造成严重威胁。
VP2蛋白
CPV的主要结构蛋白，具有诱导机体产生中和抗体的能力。
单链抗体（Single-chainFr…
基因工程抗体的一种，具有分子量小、穿透力强、免疫原性低等优点。
制备抗VP2蛋白scFv并研究其中和活性
为犬细小病毒病的预防和治疗提供新的思路和方法。
01
02
03
国内外已有多篇关于抗CPVVP2蛋白抗体的研究报道，但主要集中在多克隆抗体和单克隆抗体方面。
单链抗体技术在抗病毒领域具有广阔的应用前景，但目前针对CPV的单链抗体研究相对较少。
随着基因工程技术的不断发展，单链抗体的制备和应用将更加成熟和广泛。
构建抗CPVVP2蛋白scFv表达载体，筛选高表达菌株，纯化scFv并进行活性鉴定。
研究内容
采用PCR技术扩增VP2基因，构建原核表达载体并转化入大肠杆菌进行表达；通过亲和层析等方法纯化scFv；采用ELISA、Westernblot和中和试验等方法鉴定scFv的活性。
方法
02
实验材料与方法
抗原
犬细小病毒（CPV）VP2蛋白
抗体库
人源化单链抗体（scFv）噬菌体展示库
宿主菌
大肠杆菌（E.coli）
主要试剂
PCR试剂、限制性内切酶、T4DNA连接酶、蛋白纯化试剂等
A
B
C
D
抗原表达与纯化
将VP2蛋白基因克隆至表达载体，转化至宿主菌进行表达，通过亲和层析等方法纯化抗原蛋白。
抗体表达与纯化
将筛选得到的抗体基因克隆至表达载体，转化至宿主菌进行表达，通过蛋白纯化方法获得纯化的单链抗体。
中和活性检测
通过体外中和实验检测单链抗体的中和活性，评估其对抗犬细小病毒感染的能力。
抗体库的构建与筛选
从人源化单链抗体噬菌体展示库中筛选特异性针对VP2蛋白的抗体，通过多轮筛选获得高亲和力抗体。
1.抗原表达与纯化
转化至宿主菌进行表达
构建VP2蛋白表达载体
01
亲和层析纯化VP2蛋白
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2.抗体库的构建与筛选
从人源化单链抗体噬菌体展示库中筛选特异性抗体
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测定抗体亲和力及特异性
3.抗体表达与纯化
多轮筛选获得高亲和力抗体
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克隆抗体基因至表达载体
转化至宿主菌进行表达
蛋白纯化方法获得纯化单链抗体
4.中和活性检测
体外中和实验检测单链抗体中和活性
评估单链抗体对抗犬细小病毒感染的能力
比较不同单链抗体的中和效果
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VP2蛋白单链抗体的制备
抗体基因来源
从已免疫或未免疫的动物脾脏、外周血淋巴细胞等提取RNA，逆转录合成cDNA。
抗体库构建
利用PCR技术扩增抗体基因，与噬菌体或酵母展示载体连接，构建抗体库。
抗体筛选
采用固相化抗原或细胞筛选方法，从抗体库中筛选出特异性针对VP2蛋白的单链抗体。
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抗体表达
将筛选出的单链抗体基因转入表达载体，导入大肠杆菌等表达系统中进行表达。
抗体纯化
利用亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法对表达产物进行纯化，获得高纯度的单链抗体。
VS
采用ELISA、Westernblot等方法检测单链抗体与VP2蛋白的结合活性。
中和活性
通过体外细胞中和试验或动物体内中和试验，评估单链抗体对犬细小病毒的中和效果。同时，可进一步探讨单链抗体与病毒的结合机制，为疫苗设计和抗病毒治疗提供理论依据。
抗原结合活性
04
中和活性研究
实验分组
设立对照组、实验组及不同浓度抗体处理组。
病毒株选择
选用犬细小病毒标准株或临床分离株。
细胞培养
选用适宜的细胞系进行病毒培养，如F81细胞。
实验条件
确定最佳感染复数（MOI）和孵育时间。
病毒与抗体混合
将等体积的病毒液与不同浓度的抗体溶液混合，孵育一定时间。
结果判定
根据CPE情况，计算中和效价及半数中和浓度（IC50）。
感染细胞
将病毒-抗体混合物加入细胞培养板中，观察细胞病变效应（CPE）。
抗体稀释
将单链抗体进行连续稀释，获得不同浓度的抗体溶液。
中和效价
比较不同浓度抗体对病毒的中和效果，得出最高中和效价。
IC50值
通过数据分析，计算出半数中和浓度（IC50），评估抗体的中和活性。
抗体特异性
分析抗体对不同病毒株的中和效果，验证其特异性。
结果讨论
结合实验数据和相关文献，对中和活性结果进行深入分析和讨论。
05
结果与讨论
通过ELISA和Westernblot等实验方法验证，该单链抗体对犬细小病毒VP2蛋白具有较高的亲和力和特异性。
单链抗体的亲和力和特异性较高
通过基因工程技术和细胞培养技术，我
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