荧光定量实验方法操作基础手册.docVIP

Stratagene定量PCR仪原则曲线制作办法

定量PCR定量基本原理就是用已知拷贝数梯度稀释样品作出原则曲线，未知样品和原则曲线相比较从而得到未知样品量。无论是在基因表达分析实验还是在病原微生物检测应用中均有也许要做原则曲线，分别用于绝对定量和相对定量。

原则样品准备

1、绝对定量。绝对定量就是要拟定未知样品拷贝数。对于此类实验原则品是通过某种办法制备得到已知拷贝数具有目的片段核苷酸序列。最常用是插入有目的序列质粒，由于质粒是环状DNA有较强稳定性，并且分子量比较大定量时候比较精确。也有用线状PCR产物作为原则品，普通要比扩增目的片段要大某些，这也是为了获得分子量比较大片段，提高拷贝数精确性。原则品拷贝数是通过紫外定量办法来拟定，先得到原则品浓度C(ng/uL)，由于无论是质粒还是PCR产物它们序列都是已知，这样通过核苷酸相对分子量和原则品序列信息估算出原则品分子量B，则原则品拷贝数A(copy/uL)为：

A=C/B×6.02E+14

2、相对定量。重要是针对基因表达分析实验而来，由于要懂得都是相对数值（对照样品和实验样品中基因表达比值），这样就不需要懂得精准拷贝数，因此原则品也就不必懂得精准拷贝数，只需懂得稀释倍数就可以了。

实验中原则品可以是来源比较丰富细胞或组织RNA转录得到cDNA。将这种cDNA进行梯度稀释，可以是稀释10倍，100，1000，10000等倍（详细实验要依照详细状况来调节稀释倍数。最佳能作一种预实验来看看什么样稀释倍数比较适合这种基因扩增）。而对于各个稀释倍数要对它拷贝数进行赋值，这个值固然不是原则品中真实具有基因数量，固然在基因表达分析中也不需要，而是规定依照稀释倍数给每一种稀释度人为赋予拷贝数，这只是为了以便实验最后成果计算而已。例如可以把前面稀释十倍样品赋值为10000个拷贝，100倍赋值为1000个拷贝依次类推把10000倍赋为10等。要注意，赋值数目倍数差别和稀释倍数应当是同样，例如前面是10稀释，背面赋值也是10倍变化。

如何做原则曲线

在定量实验中原则品是要和未知样品一起进行定量实验，这样在实验结束，无论是原则品还是未知样品都将跑出曲线，获得了Ct值。那么先可以把未知样品放到一边，对于原则品来说，既获得了Ct值，还懂得她们拷贝数（虽然对于相对定量来说这个拷贝数是咱们自己赋予）。这样可以通过原则品Ct值和拷贝数做一条原则曲线（以拷贝数为横坐标，而Ct值为纵坐标）。一旦作出了原则曲线，而未知样品Ct值懂得（通过实验求得），这时候就在原则曲线上进行定位，就可以得到未知样品拷贝数了。

事实上，操作起来没有那么复杂，只需要告诉软件哪个孔是原则品，哪个是未知样品，以及原则品拷贝数等必要信息，软件会自动帮把原则曲线和未知样品拷贝数计算出来了。

举例来说如何进行设立

1、先进入软件，在板设立中选取所放样品位置，并标上unknow或standard等信息。

2、选取要使用荧光染料。

3、设立复孔。

如果有些孔有重复就用用样数字标明，这样仪器就懂得哪些是重复，最后成果解决话也可以取平均等操作。

有相似标号系统就以为是同样样品重复。

4、原则品赋值

接下来要给原则品赋上值，系统要懂得按照什么去计算

原则品赋值要先选上要赋值原则品，然后在工具面板中输入相应值。

自动增长稀释倍数填入原则品量

自动增长稀释倍数

填入原则品量

为了以便设立系统有一种自动增长稀释倍数设立，点开后就可以选取你稀释倍数，然后用鼠标去选取孔时候会自动增长

选取稀释倍数

每次选取不同孔，在里面赋值会自动按照倍数增长

5、设立温度

在这里提供一种对于SYBR染料惯用温度控制模板，可以参照。注意最后溶解曲线制作过程在升温过程中选取标有all放大镜，代表从55℃到95

6、设好了之后可以运营程序了，最后原则曲线和扩增曲线系统会自动给出，也会算出未知样品拷贝数。

Stratagene荧光定量PCR仪基因表达分析解决方案

Stratagene荧光定量PCR仪和配套Mxpro软件在解决基因表达分析方面功能比较强大，下面简要阐明如何使用该软件来进行基因表达分析。

例如要分析IL1基因表达状况，用看家基因GAPDH作为内参，采用是SYBRGreenI染料法。

1、板设立

1.1、专门基因表达分析实验模式。打开Mxpro程序操作窗口，一方面弹出对话框是要顾客选取要进行实验类型，做基因表达分析可以选取第二项ComparativeQuantitation(Calibrator)。

1.2、以便类型选取和孔设定。在板设立中选取样品类型，可以将样品名称写成GAPDH和IL1，并将GAPDH设为看家基因（NORM），这样设立非常清晰，有助于分析成果。如果实验中使用了复孔，则在复孔上标上相似数字，代表这些样品是重复，下图中每个样品重复三次。

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