食品免疫学免疫检测技术与食品安全检测.docVIP

第八章免疫学技术

第一节抗原抗体的制备

一、抗原的制备

制备特异性的抗原是制的合格抗体的前提条件，而作为检测诊断的抗原也必须是纯化的抗原。抗原的物质很多，很少是单一成分，必须从复杂的组分中提取分离。

按抗原的物理状态，可分为天然抗原、人工抗原和合成抗原三类。

1、天然抗原的制备

（1）颗粒性天然抗原

常见的颗粒抗原涉及动物、植物、微生物的细胞，和有关的细胞组成结构，如细胞的细胞壁、线粒体，细菌的鞭毛和菌毛等。

一般环节为：一方面收集抗原细胞或（和）扩增培养，然后离心或过滤收集细胞或细胞组成结构物，再进行病原微生物灭活。

（2）可溶性抗原的分离纯化

蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶、补体、细菌毒素、免疫球蛋白片段、核酸等皆为良好的可溶性抗原，免疫前常需纯化。

细胞破碎方法有：冻融法；超声破碎；高速组织捣碎机法；研磨法；溶菌酶、蜗牛酶、纤维素酶解决

可溶性蛋白抗原的分离方法：

离心分离法：差速离心、密度梯度离心

选择沉淀法：盐析沉淀法；有机溶剂沉淀法，常采用乙醇或丙酮

核酸去除法，DNA酶、RNA酶解决；

水溶性非离子型聚合物沉淀法：常用非离子型聚合物为分子量为2023～6000的聚乙二醇（PEG）

凝胶过滤法：又称分子筛层析。通过凝胶分子筛作用，可将大、中、小三类分子分开，选择凝胶柱时应注意选用适于分离范围内的凝胶。

离子互换层析法：离子互换层析是运用一些带电离子基团的凝胶或纤维素吸附带有相反电荷的蛋白质抗原。

亲和层析法：亲和层析是运用生物分子间所具有的专一性亲和力而设计的层析技术。如抗原和抗体、酶和酶克制物、酶蛋白和辅酶、激素和受体、DNA和RNA等之间有特殊亲和力，一定条件下，两者可紧密结合成复合物，如将复合物的一方固定于固相载体上，则可从溶液中分离和提纯另一方。

纯化抗原的鉴定

重要对纯化抗原的含量、理化性质、纯度及免疫活性进行鉴定，常用方法有酚试剂法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、免疫电泳法、免疫双扩散法等。

2、人工抗原的制备

人工抗原指通过人工修饰的半抗原，即将半抗原与载体连接后形成的完全抗原。

小分子半抗原可以是多糖、多肽、核酸、类固醇激素、某些药物及其它化学物品。

在食品检查中常见的小分子半抗原有各种农药、兽药、添加剂与非法添加物（盐酸克伦特罗）、真菌毒素等等。

常用载体：蛋白质、多肽聚合物、大分子聚合物。

蛋白质：常用牛血清白蛋白（bovineserumalbumin,BSA）、卵清白蛋白（OVA）、人血清白蛋白（HSA）、兔血清白蛋白（RSA)。

多肽聚合物：常用多聚赖氨酸。

大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲基纤维素(CMC)等皆可与半抗原结合，加入弗氏佐剂课产生良好的抗体。

连接方法：

物理法是用物理吸附法将载体与半抗原连接，其原理是通过电荷和微孔来吸半抗原，吸附载体重要有PVP和CMC等；

化学法是运用某些功能基团把半抗原连接到蛋白质类或多肽类聚合物载体上。不同的半抗原应选用不同的方法进行连接。

根据半抗原拥有的化学基团不同，连接方法重要有以下几类：

①带游离氨基或羧基以及二种基团皆有的半抗原：羧基可用混合酸酐法和碳二亚胺法与载体氨基形成稳定的肽键，带氨基的半抗原则可与载体羧基缩合。

②带有羟基、酮基、醛基的半抗原：不能直接与载体连接，需要用化学方法如琥珀酸酐法、O-（羧甲基）羟胺法等方法将之转变为带有羧基的半抗原衍生物后才干与载体连接。

③带有酚基的半抗原：可用一氯醋酸钠法或重氮化的对氨基苯甲酸法，生成带有羧基的半抗原衍生物。

3、免疫佐剂

某些物质与抗原一起或先于抗原注入机体，可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型，此类物质称为佐剂(adjuvant)。

应用最多的佐剂为福氏佐剂

福氏不完全：石蜡油+羊毛脂

福氏完全：石蜡油+羊毛脂+卡介苗

乳剂的制备：

乳剂：抗原与佐剂的混合物

抗原与佐剂的比例为1:1，注射前要充足乳化

二、多克隆抗体的制备

1、免疫动物的选择

选择动物时应考虑以下因素：

抗本来源与动物种属的关系。抗原的来源与免疫动物种属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。

动物个体的选择。适龄、健康、体重符合规定的正常动物（以雄性为佳）；

抗体的用途和量：抗体需要量少时，选用家兔、豚鼠和鸡等小动物；抗体需要量大时，可选用绵羊、山羊、马、驴等大动物。

2、免疫方法

选定动物后，在免疫过程中应考虑免疫剂量、免疫途径、免疫次数、免疫间隔等因素。

痹。

（1）免疫原的剂量：免疫原的接种剂量按免疫原性的强弱、动物的个体状态和免疫时间来拟定。

小鼠初次剂量50-400ug/次。大鼠：100-1000ug/次。兔子：200-1000ug/次。加强免疫剂量为初次剂量的1/5-2/5