碱基顺序的化学分析法公开课一等奖优质课大赛微课获奖课件.pptx

3.5核酸碱基顺序分析中化学办法DNA化学顺序办法于1977年由A.M.Mamamx和W.Gilbert第一次报道，因此又称为M＆G法（化学降解法）。这一办法是将模板DNA一端标识，之后按碱基顺序逐一地将整个大分子断裂，标识DNA片段长度或大小与每个碱基所在位置相相应，当这些反应产物通过变性聚苯稀酰胺凝胶电泳分离后，其代表DNA顺序便能够从同位素标识自显影带形上读出。这项技术能够测出距离标识位点250核苷酸以内DNA序列。通过多年努力在模板DNA末端标识和特异性化学反应方面都进行了改进，使这一办法成为DNA序列分析基本办法。第1页第1页

化学降解法测序原理在M＆G法测序系统中，一个末端标识DNA片段在4组或5组互为独立化学反应中分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一个或某一类碱基。在这几组反应中经过化学裂解形成放射性标识分子含有共同起点——放射性标识末端，而其终点不同——发生化学降解位点。每组混合物中含有长短不一DNA分子，其长度取决于该组反应所针正确碱基在待测DNA全长片段中位置。此后，将各组反应产物进行序列胶高压电压分离，再经过放射自显影显示序列结果。第2页第2页

原理示意图第3页第3页

办法成败关键一、对特定碱基进行化学修饰二、通过修饰碱基从糖环上脱落，DNA主链在修饰碱基5’和3’磷酸二脂键断裂。第4页第4页

DNA样品制备

待测DNA样品末端标识

单末端标识DNA片段分离纯化

碱基特异化学裂解反应

序列胶高压电泳分解

读取序列化学法测序普通流程第5页第5页

载体选择

化学法中用最多是Messing及其同事构建pUC系列载体。它们是化学法测序中比较好载体。第6页第6页

Puc质粒系列图谱第7页第7页

Psp64/图谱第8页第8页

DNA样品制备DNA样品必须是来自转化细胞单菌落，绝对不含有宿主细胞染色体DNA及其RNA。1、氯化铯-溴化乙啶梯度平衡离心法纯化质粒DNA。2、寡核苷酸——从固相支持物上洗脱下寡核苷酸不含有5’末端磷酸基团。测序前用高压液相柱或电泳技术纯化进行5’末端标识。第9页第9页

DNA样品末端标识Klenow片段酶介导标识反应1.在一支微量离心管中加入：含有3’凹端DNA片段3种dNTP混合液Klenow片段酶缓冲液ａ-32P-dATP2.混合均匀后加入0.5微升Klenow片段酶，混匀后置于20-22℃保温30分钟。3.70℃加热10分钟终止反应。第10页第10页

单末端标识DNA片段分离和纯化普通采用变性DNA中性琼脂糖凝胶和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳办法进行分离。最惯用洗脱办法是机械洗脱和电洗脱，当前已有许各种商品化电洗脱装置，性能优良回收率高。第11页第11页

双链DNA解链及两条链分离回收双链DNA变性1.在一支微量离心管中加入32P标识DNA片段;变性加样溶液2.混匀后置于90℃保温2分钟，快速放入冰浴冷却。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离制备一块适宜浓度非变性聚丙烯酰胺凝胶确定凝胶中放射性标识DNA片段位置1.电泳结束后，轻轻去掉一块玻璃板，用保鲜膜盖住胶，再将放射性溶液取几滴于3㎜滤纸条上，置于胶不对称四点上，用透明胶带固定。将整个凝胶投入X射线胶片暗合内，上面覆盖一张X射线胶片进行放射自显影。室温曝光5-10分钟后显影、定影。不同大小片段便展现出来。2.将凝胶上四处人为标识与X射线胶片上对应显影点重合，则对应于X射线胶片上DNA单链显影处凝胶必定含有这个单链标识DNA片段。用注射器针头沿显影条带四周穿孔并直入凝胶内，再将已被针孔划出范围凝胶用锐利刀片切割下来，放入一支离心管中。第12页第12页

从聚丙烯酰胺凝胶中洗脱回收DNA办法一机械性洗脱【碾碎-浸泡-过滤-沉淀法】1、将切下胶块置于1.5ml微量离心管中2、用洁净玻璃棒将胶块捣碎3、加入400μl洗脱缓冲液4、盖好管盖并用parafilm膜封口5、37℃震荡至少4小时或过夜6、用硅化玻璃棉装入一个1ml枪头7、将洗脱液过滤到一支微量离心管中8、再另加100μl洗脱缓冲液到洗脱管中洗脱残余样品9、重复710、用手提式射线监测器监测过滤样品，样品应大部分得以回收11、像过滤样品中加入1.0ml无水乙醇，-70℃放置5分钟沉淀DNA样品12、在4℃以15000r/min离心1