核酸的鉴定与保存课件.pptVIP

第五章核酸的分离纯化

核酸的结构与功能是分子水平生命活动的基础；内源基因的突变、表达及调控的异常和外源致病基因的侵入是人类疾病发生、发展的根源。

DNA、RNA是生物体中最重要的核酸分子，是分子生物学和分子诊断的研究对象。DNA、RNA的分离纯化是分子生物学研究及对疾病进行分子诊断的最基础工作。

核酸分离纯化的原则一、保持核酸一级结构的完整性二、尽可能提高核酸制品的纯度

1保证核酸一级结构的完整性；2其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；3核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；4其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。

第一节核酸分离纯化的设计及原则第二节基因组DNA的分离纯化第三节质粒DNA的提取与纯化第四节RNA的分离纯化

第一节核酸分离纯化的设计及原则

一、材料与方法的选择二、技术路线的设计三、核酸的鉴定与保存

（一）材料与方法的选择（二）选择原则

（一）材料与方法的选择不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度可能有不同的要求?需考虑制备核酸所需的时间与成本?应选择安全的试剂与制备方案

（二）选择原则1、保持核酸碱基序列的完整性2、尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度3、保持核酸的完整性应尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间尽量避免各种有害因素对核酸的破坏

（一）核酸的释放（二）核酸的分离与纯化（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤

（一）核酸的释放DNA和RNA均位于细胞内（病毒除外），因此核酸分离与纯化的第一步即是裂解细胞、释放核酸。

应用细胞破碎方法1匀浆法机体软组织动物韧性组织细菌、酵母细胞混悬液培养细胞Ⅰ机械法Ⅱ物理法2捣碎法3研磨法1超声法2反复冻融法3冷热交替法4低渗裂解1有机溶剂2去垢剂细菌、病毒红细胞细菌、酵母组织、培养细胞细菌、酵母Ⅲ化学法3酶解法

核酸的释放：破裂细胞释放核酸机械法与非机械法（非机械法中溶胞法是应用最广泛的方法）核酸的分离与纯化：将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其他物质分离非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液

（二）核酸的分离与纯化应该清除的杂质主要包括三部分1、非核酸的大分子污染物：蛋白质、多糖及脂类物质等2、非需要的核酸分子：分离某一特定的核酸分子时，其它的核酸分子皆为杂质3、加入的有机溶剂和某些金属离子

（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤?沉淀是浓缩核酸的最常用的方法?常用的盐类有醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁?常用的有机溶剂则为乙醇、异丙醇和聚乙二醇?核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用70%～75%的乙醇洗涤去除

（一）核酸的鉴定（二）核酸的保存

（一）核酸的鉴定1、浓度鉴定2、纯度鉴定3、完整性鉴定

1、浓度鉴定⑴紫外分光光度法：该法是基于核酸分子中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm。

各种碱基的紫外吸收光谱

⑵荧光光度法：核酸的荧光染料溴化乙锭嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV激发下发出红色荧光，且荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。

EB与DNA的结合

2、纯度鉴定⑴紫外分光光度法：该法主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染，比值升高与降低均提示不纯。在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280为1.8纯RNA的A260/A280比值为2.0

1.DNA或RNA的定量OD=1.0相当于26050μg/ml双链DNA40μg/ml单链DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度DNA纯品:OD/OD=1.8260280RNA纯品:OD/OD=2.0260280

紫外分光光度法：测定DNA在A的光吸收值。260nm如计算DNA浓度A260×稀释倍数×50＝μg/ml(A值等于1时，相当于50μg/ml双链DNA，40μg/ml单链DNA或RNA，20μg/ml单链寡核苷酸）紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液。

⑵荧光光度法：用EB等荧光染料示踪的核酸电泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA分子较RNA大得多，电泳迁移率低。

荧光光度法荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（1-5ng）

3、完整性鉴定⑴琼脂糖凝胶电泳法：以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果可判定核酸制品的完整性。基因组DNA片段的分子量很大，在电场中泳动很慢，如果发生降解，电泳图呈拖尾状。

DNA片段的降解

?完整或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带荧光强度积分应呈特定的比值，沉降系数大的核酸区带，电泳迁移低，荧光强度积分高；反之，分子量小