WB实验步骤总结.docx

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蛋白提取〔全部操作在冰上进展〕

裂解

配裂解液:PMSF=100:1,〔裂解液和PMSF在-20℃保存,提前一天4℃解冻〕取2ml裂解液,加20μlPMSF混匀

称取30mg组织,切碎放入标记好的AP管中,参加600μl上述1中液体〔参加液体与组织比例为20:1〕,冰上静置10min

匀浆

先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头,〔同时进展几组匀浆时,组间也要润洗钢头〕在匀浆机〔在生化室〕上每次匀浆10s,两次〔间隔5s〕,冰上静置30min

离心〔在根底4楼416室〕

自带1ml枪以及蓝枪头和黄枪头,三个1.5的离心管〔①,②两个标记,③加少量超纯水,③号是为了离心平衡,对称放置〕

将离心机预冷至4℃为止,以1200×10r/min离心15min

用移液枪将上层清液取出放入①②号管中

变性〔上样缓冲液:样品=4:1〕将样品转移至2~3个0.5mlAP管中加上样缓冲液,100℃变性10min仪器屏幕:

S5

S5

00:10

S5

100.0

00:10

温度〔℃〕

时间〔时:分钟〕

保存

变性完毕后,翻开AP管盖放一下气,然后4℃保存,点样是取出即可用

WB试验步骤

清洗玻璃板:清洗玻璃板后风干,将玻璃板对齐后放入夹中卡紧,操作时要使两玻璃对齐,以免漏胶。

配制分别胶

预备:1ml枪〔蓝色枪头〕,200μl枪〔黄色枪头〕10μl〔白色枪头〕

10%分别胶的配置:〔用50ml烧杯。1.0mm板配1.5块胶,1.5mm板配2块板〕

5.91ml

5.91ml

超纯水

4.95ml

丙烯酰胺〔30%〕避光保存极易失效

3.75ml

Ph8.8Tris?HCL

150μl

10%SDS

150μl

AP〔催化剂促凝作用〕

9μl

TEMED

混合摇匀〔用移液枪抽吸混匀液体,不要将液体完全打出防止气泡〕

灌胶

沿玻璃板右上角缓慢匀速参加分别胶〔用1ml移液枪,不要将移液管内液体完全打出防止气泡〕保持液面平稳上升至上方绿色线为止

水封

马上用1ml超纯水进展水封〔利用重力把胶压平〕,如有气泡则用针头吸出防止影响电泳效果,等待20-30min

5. 浓缩胶的配制〔5%〕

4.13ml

超纯水

1ml

750μl

丙烯酰胺〔30%〕避光保存极易失效

Ph6.8Tris?HCL

60μl

10%SDS

60μl

AP〔催化剂促凝作用〕

6μl

TEMED

搅拌混匀马上灌胶至溢出,插入梳子〔10孔或15孔〕凝胶30min或20min

电泳〔电泳液最多使用两次〕

安装电泳装置

低板对内,上方夹住,往两板中参加电泳液至黑线并观看是否漏液,缓慢拔掉梳子〔留意两手平衡拔出防止拔歪〕

点样〔不易时间过长,防止样品条带集中〕

Mark

Mark

4μl

〔Proternladder〕推举9μ,实际4μ已经足

样品

8μl

7-10μl均可内参挑齐即可

组数少时尽量靠中间点样,边缘易跑歪

连接电泳仪

电泳池与电泳盖连接:黑对黑,红对红电永池的两个电极插入电极盖孔内,翻开开关恒压电泳先调电压至70mV,跑约20min。〔Mark跑开,分出彩带即可〕

再调电压至120mV,跑约60min。〔不能跑过下面的玻璃板〕

注:Mark的条带从红色条带往下依次为:70→55→40→35→20,待测蛋白的分子量再哪一区域就在哪一段剪。用绿色的切板切割待测区域,边缘留点空余,以防止切到条带。放入装有转移液的皿中浸泡

转膜〔转移液可用3-4次〕

剪四层滤纸〔大小与膜相,近可大不行小〕浸入转移液皿中。然后再讲其剪成与胶全都大小〔胶始终保持潮湿〕

剪PVDF膜〔用上述滤纸,勿用手直接接触PVDF膜〕,然后用甲醇活化10s以上

“夹三明治”再大塑料盆中参加少量转移液,将夹板、海绵、滤纸、膜均放入浸泡,夹板黑板在下、两层滤纸→胶→膜→两层滤纸〔胶的大分子量条带在上方,即在右上方〕

安装转膜装置:黑板对黑板,电极黑对黑,红对红。参加转膜液至满〔否则仪器无法启动〕

翻开开关,调整电流至100mA,转膜2h〔恒流〕盆中加满冰转膜成功标志:胶上的条带均转移的膜上,胶呈无色

封闭

小烧杯中混匀参加皿中配制5%脱脂奶粉:2.5g脱脂奶粉50mlTBST

小烧杯中混匀参加皿中

将膜取出放入上述参加了5%脱脂奶粉中的皿中常温慢摇60min〔转移液回收其余清理掉,转移液可以重复利用2次〕

一抗

2l〔Psmad2l〕免抗1:10005μl:5ml58〔分子量〕2l〔Psmad2l〕免抗1:50010μl:5ml58

2l〔Psmad2l〕免抗

1:1000

5μl:5ml

58〔分子量〕

2l〔Psmad2l〕免抗

1:50

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