一种抗禽流感的功能性饲料添加剂的制备方法.pdfVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利说明书

(10)申请公布号CN102550864A

(43)申请公布日2012.07.11

(21)申请号CN201210000741.0

(22)申请日2012.01.04

(71)申请人河南科技大学

地址471000河南省洛阳市涧西区西苑路48号

(72)发明人冯书营王臣赵战勤李爱芳张小娟薛乐勋

(74)专利代理机构洛阳公信知识产权事务所(普通合伙)

代理人苗强

(51)Int.CI

权利要求说明书说明书幅图

(54)发明名称

一种抗禽流感的功能性饲料添加剂

的制备方法

(57)摘要

一种抗禽流感的功能性饲料添加剂

的制备方法，将人工合成H5N1亚型禽流

感病毒血凝素基因的部分片段和真核表达

载体pBI-221连接获得重组质粒，通过基

因枪、电转化等转化方法将获得的重组质

粒转化入杜氏藻细胞，使血凝素在杜氏藻

细胞中表达，制备得到表达病毒蛋白亚单

位的工程藻；将制备的工程藻细胞进行开

放式扩大培养后，收集藻体，然后经低温

干燥、制粒等加工工艺过程，得到一种抗

禽流感的功能性饲料添加剂。本发明所制

备的饲料添加剂应用于禽类养殖业具有抗

禽流感的免疫保护作用，能够提高禽类机

体的免疫力和生长速度，并且无任何毒副

作用，生物安全性好。

法律状态

法律状态公告日法律状态信息法律状态

权利要求说明书

1.一种抗禽流感的功能性饲料添加剂的制备方法，其特征在于：其具体步骤为：

步骤一、工程藻的制备

（1）H5N1禽流感血凝素基因的制备：根据GenBank中登录的H5N1亚型禽流感

病毒的血凝素基因序列，人工合成血凝素基因的部分片段，其基因序列如序列表序

列1，然后采用PCR的方法对该基因片段进行扩增；PCR的上游引物为p1：

5’uTCTAGA/uATGCGCAGCATGTCCATACCATA3’，下游引物为p2：

5’uGAGCTC/uAATGTGGATTCTTTGTCTGC3’，下划线所指为上下游引物

分别引入的iXba/i?和iSac/i?酶切位点；

（2）真核表达载体的pBI-HA构建：将鉴定正确的血凝素基因片段进行

iXba/i?和iSac/i?双酶切，然后采用胶回收试剂盒回收血凝素基因片段片

段；将真核载体pBI-221进行iXba/i?和iSac/i?双酶切，同样进行胶回收

载体片段；然后通过T4连接酶连接血凝素基因片段和真核表达载体pBI-221，将

连接体系转化入大肠杆菌感受态，挑选阳性菌落培养后进行质粒的提取，采用

iXba/i?和iSac/i?进行双酶切鉴定血凝素基因片段是否成功构建入真核表

达载体中，得到正确的pBI-HA重组质粒，备用；

（3）利用电转化法将重组质粒转化杜氏藻细胞：将鉴定正确的重组质粒通过基因

枪、电转化等转化方法将重组质粒转化入杜氏藻细胞；通过对转基因细胞的筛选，

结合分子生物方法的鉴定，得到表达禽流感病毒亚蛋白单位的工程藻细胞；

步骤二、工程藻的扩大培养

将步骤一制备的表达禽流感病毒亚蛋白单位的工程藻细胞接种到15L玻璃瓶中进

行扩大培养，当细胞生长至对数生长期时，按1%的接种量接种于天然海水的藻类

养殖场，进行规模化的生产培养，培养约10-14天，细胞的浓度增加为

10sup6/sup个/ml；

步骤三、工程藻的收集和加工处理

当工程藻细胞生长至10sup6/sup个/ml时，对藻类细胞进行收集；可以采用静

止沉降或离心沉降法，批量的收集藻体；收集后的藻体经过低温干燥、制粒或与其

它营养成分混合加工后，得到一种抗禽流感的功能性饲料添加剂。

说明书

p技术领域

本发明涉及饲料添加剂领域，具体地说是一种具有抗禽流感病毒感染的禽用功能性

饲料添加剂