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(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利说明书
(10)申请公布号CN1858250A
(43)申请公布日2006.11.08
(21)申请号CN200610034313.4
(22)申请日2006.03.15
(71)申请人中国水产科学研究院南海水产研究所
地址510300广东省广州市新港西路231号
(72)发明人杨贤庆李来好岑剑伟郝淑贤刁石强吴燕燕石红周婉君陈胜军
(74)专利代理机构广州知友专利商标代理有限公司
代理人宣国华
(51)Int.CI
C12Q1/68
C12Q1/04
权利要求说明书说明书幅图
(54)发明名称
一种香港海鸥型菌快速检测试剂盒
及检测方法
(57)摘要
本发明提供一种香港海鸥型菌快速
检测试剂盒及检测方法。该试剂盒及检测
方法是以香港海鸥型16sRNA保守片段序
列设计的一对引物为主体而设计的。本发
明采用聚合酶链式反应(PCR)技术,反应产
物在琼脂糖电泳上显示特异的谱带。对淡
水鱼肠道中的香港海鸥型菌的特异性DNA
片断进行定性检测,简便快速,特异性
好,灵敏度高;可用于可致人严重肠胃炎
的病原菌—香港海鸥型菌的检测,对提高
我省淡水产品食用安全性有很大的社会经
济效益,具有很高的实用价值。
法律状态
法律状态公告日法律状态信息法律状态
利要求说明书
a.裂解液1瓶,内含8-12mmol/LTris-HCl,1-3mmol/LEDTA,0.1%-0.5%SDS,
pH7.5-pH8.5;
b.醋酸钾溶液1瓶,内含2-3mol/L醋酸钾溶液;
c.TE缓冲液1瓶,内含50mMEDTA,0.1-0.5mol/LpH7.0的Tris-HCl缓冲液;
d.PCR反应液1管,内含8-15%蔗糖、0.1-0.3mM甲酚红、1-3unitTaq酶、100-
dNTP、含Mgsup2+/sup的10×缓冲液、0.2μM上下游引物,
上游引物序列为GAGTGGCGAACGGGTGAGTA
下游引物序列为TGTCTCCCAGCGATTCGGCG;
e.阳性对照液1管,内含较高浓度的香港海鸥菌总DNA;
f.盒子。
2根据权利要求1所述的香港海鸥型菌快速检测试剂盒,其特征在于:所述的含
Mgsup2+/sup的10×缓冲液包含2-3mMKCL、0.1-1mMTris-HCl、0.1-
0.5mMMgClsub2/sub。
3一种香港海鸥型菌快速检测方法,其特征在于使用权利要求1的试剂盒,按以下
步骤进行:
a.样品的预处理:取样品适量,按料水比1∶4加入无菌水,充分振荡悬浮,离心,
弃去上清夜;
b.在沉淀物中加入0.5-1ml裂解液,充分悬浮沉淀,精确沸水浴2-5min;
c.加入200μl醋酸钾溶液漩涡振荡,冰浴2min,12000r/min离心5-10min;
d.上清液转移至载有500μl异丙醇的离心管,振荡充分混合,以12000r/min的速度
离心3-5min,弃去上清液;
e.加入0.5ml70%乙醇,振荡30s,12000r/min离心3-5min,吸去上清液,室温干
燥5min,加入20-50μlTE缓冲液漩涡振荡,得样品PCR模板;
f.PCR反应
将PCR反应液加入到中反应管,再分别取样品模板和阳性对照液,将已加样的反
应管置于PCR仪上;
g.按下列条件进行扩增
94℃3-5min预变性→94℃变性30-50s→57℃复性50s→72℃延伸1min→(第二步至
第四步25-35个循环)→72℃延伸5-10min→4℃保存;
h.反应结束后取上述PCR产物5-10μl直接点样于浓度为1-1.5%琼脂糖凝胶
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