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PCR技术及其在动物科学领域中的运用

摘要：聚合酶链式反响〔PCR〕是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火〔复性〕及适温延长等几步反响组成一个周期，循环进展，使目的DNA得以快速扩增。近年来，PCR技术快速进展并与其他技术结合衍生出了荧光定RT-PCR、PCR-DGGE，多重PCR等一系列技术，运用领域也不断拓宽，已被广泛地用于微生物学、医学、免疫学等领域。本文通过介绍PCR技术及其在动物科学领域中的运用，使读者对PCR技术有初步的了解并对其运用领域有概况性的生疏，更是为了今后的科学争论积存了更多的学问和供给了技术上的支持。

关键词：荧光定量PCR RT-PCR探针引物

〔一〕PCR技术简介及其运用概述

聚合酶链式反响〔英文全称：PolymeraseChainReaction〕，简称PCR。聚合酶链式反响〔PCR〕是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火〔复性〕及适温延长等几步反响组成一个周期，循环进展，使目的DNA得以快速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分别、克隆和核酸序列分析等根底争论，还可用于疾病的诊断或任何DNA、RNA的地方。聚合酶链式反响又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物

定向酶促扩增技术。

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1、PCR技术原理

2、PCR工作原理双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，依据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝，在试验中觉察，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化掌握DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，参加DNA聚合酶、dNTP

2、PCR工作原理

类似于DNA的自然复制过程，其特异性依靠于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性—退火—延长三个根本反响步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至90~95℃肯定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反响作预备；②模板DNA与引物的退火：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55~60℃，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延长：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于70~75℃，以dNTP为反响原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保存复制原理，合成一条的与模板DNA链互补的半保存复制链重复循环变性--退火--延长三过程，就可获得更多的“半保存复制链”，而且这种链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

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3、PCR种类及运用

、RT-PCR原理：首先提起RNA，然后用逆转录酶与MRNA为模板进展CDNA第一链的合成，其原理同PCR.。RT-PCR是个半定量的试验，可以确定在MRNA水平的表达差异，即在转录水平。

、免疫PCR(immunopolymerasechainreaction,IPCR)原理：是用一段DNA分子标记抗体作为探针,用此探针与待测抗原反响,PCR扩增粘附在抗原抗体复合物上的这段DNA分子,电泳定性,依据特异性PCR产物的有无来推断待测抗原是否存在。免疫PCR是迄今最敏感的一种抗原检测方法,理论上可以检测单个抗原分子,但实践中它的敏感性受很多因素的影响,如连接分子、显示系统的选择、DNA报告分子的浓度、PCR循环次数等。由于PCR产物在抗原量未到达饱和前与抗原抗体复合物的量成正比,因此免疫PCR还可用于抗原的半定量试验。

、巢式PCR原理：是用内外两对引物扩增拷贝数较低的片段。先用外引物进展第一轮反响,将产物适当的稀释,然后用内引物连续扩增.巢式PCR比较适合微量DNA或者石蜡组织抽提的DNA。

、实时荧光PCR 原理：利用荧光来检测PCR产物，PCR每循环一次就收集一个数据，通过实时扩增曲线，准确确定CT值，从而确定其实DNA拷贝数。实时PCR，属于定量PCR〔Q-PCR〕的一种，以肯定时间内DNA的增幅量为根底进展DNA的定量分析。实时PCR的定量使用荧光色素，目前有二种方法，一种是在dsDNA中插入特异的荧光色素，例如SYBRGreen荧光染料；另一种使用一种能与增幅

DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种荧光探针〔 probe〕，如Taqman探针。两种方法原理不同。SYBRGreen荧光染料游离时不发光，当反响体系中存在双链DNA时，SYBRGreen