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PCV2、PRV、PPV多重PCR检测方法的建立及其应用

辛长勋;李俊;郑书轩;时建立;彭喆;吴晓燕;高梅;刘玉伟;王硕;王金宝

【摘要】依据GenBank中已发表的猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)有关基因序列,通过序列比对及参考相关文献,设计了3对特异性

引物.通过优化,建立了可同时检测PCV2、PRV及PPV3种病毒的多重PCR方法.结果说明,该方法能同时检测到PCV2、PRV及PPV的最低核酸量分别为40pg、72pg、46pg.对猪圆环病毒3型(PCV3)、猪细环病毒(TTSuV)、猪流行腹泻病毒

(PEDV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)无扩增.应用该方法对87份临床样品进展检测,PCV2阳性检出率为28.7％(25/87),PRV野毒检出率为11.5％

(10/87),PPV检出率为12.6％(11/87).其中2种以上病毒混合感染阳性率为13.8％(12/87),3种病毒同时感染的阳性率为2.3％(2/87),其结果也与单一PCR结果全都.争论结果提示,该方法可用于PCV2、PRV、PPV三种病原的单一感染或混合感染

的鉴别诊断.

【期刊名称】《家畜生态学报》

【年(卷),期】2023(040)002

【总页数】4页(P65-68)

【关键词】猪圆环病毒2型;猪伪狂犬病毒;猪细小病毒;多重PCR

【作者】辛长勋;李俊;郑书轩;时建立;彭喆;吴晓燕;高梅;刘玉伟;王硕;王金宝

【作者单位】青岛农业大学动物医学院,山东青岛266109;山东省农业科学院畜牧兽医争论所,山东济南250100;青岛农业大学动物医学院,山东青岛266109;山东省农业科学院畜牧兽医争论所,山东济南250100;青岛农业大学动物医学院,山东青

岛266109;山东省农业科学院畜牧兽医争论所,山东济南250100;山东省农业科学

院畜牧兽医争论所,山东济南250100;山东省农业科学院畜牧兽医争论所,山东济南250100;山东省农业科学院畜牧兽医争论所,山东济南250100;山东师范大学生命科学院,山东济南250014;山东师范大学生命科学院,山东济南250014;山东师范大学生命科学院,山东济南250014;青岛农业大学动物医学院,山东青岛266109;山东省农业科学院畜牧兽医争论所,山东济南250100

【正文语种】中文

【中图分类】S811.5

近年来，随着中国养猪业规模化、集约化进展，猪病的发生和流行对养猪生产的危害日趋加重，且多病原混合感染已成为当前猪群疫病流行的主要形式与特点[1]。猪圆环病毒2型(porcinecircovirustype2，PCV2)、猪伪狂犬病毒(pseudorabiesvirus，PRV)和猪细小病毒(porcineparvovirus，PPV)这3种病原是危害养猪业的主要DNA类病毒[2]，给中国养猪业造成了严峻的经济损失。试验室对上述3种疫病的诊断主要包括免疫荧光、酶联免疫吸附试验[3]、荧光定量PCR等[4]，但这些方法有的耗时费力，有的在实际应用中有肯定的局限性。如今较常使用的仍是常规的PCR技术，但是一一检测多种病原也存在耗时费力的问题。而承受多重PCR技术可实现同时检测多种病原[5]，因此建立一种快速牢靠的多重PCR检测方法对提高猪群疫病诊断的实效性具有重要的现实意义。

目前，中国普遍使用Bartha-k61株弱来防控猪伪狂犬病，其基因组中缺失整个gE序列[6]。其它一些疫苗也大多为gE基因的缺失疫苗[7]。因此，本争论依据PRVgE基因序列、PCV2和PPV基因序列，建立了可以快速鉴别PRV野毒、PCV2、PPV的多重PCR检测方法。

材料与方法

病毒毒株

PCV2及PRV野毒株由山东省畜禽疫病防治与繁育重点试验室保存；猪细小病毒灭活疫苗购自上海某生物技术股份。

临床样品

2023～2023年收集的87份病料，包括器官、组织及血液等。

主要试剂

SuperStarMaxDNAPolymerase、dNTPS购自北京康润诚业生物科技；DL-2023DNAMarker购自大连宝生物工程。

DNA模板的提取

用酚氯仿抽提法提取DNA。具体方法如下：将病毒液或疫苗液反复冻融3次后，取出500μL于1.5mL离心管中，参加50μL10%SDS溶液和10μL(20mg/mL)的蛋白酶K，于56℃恒温水浴锅中消化1.5～2h；参加2