猪圆环病毒1型、2型、3型三重实时荧光RT-PCR检测方法.pdfVIP

猪圆环病毒1型、2型、3型三重荧光PCR检测方法

1范围

本文件描述了猪圆环病毒1型、2型、3型三重荧光PCR检测方法的试剂与材料、仪器与设备、实验

前准备、操作步骤、结果判定等内容。

本文件适用于猪血液、肺、扁桃体或脑等病灶组织及环境样品中猪圆环病毒1型、2型、3型的核酸

检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T35901猪圆环病毒2型荧光PCR检测方法

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

实时荧光PCR：实时荧光聚合酶链式反应（Real-timePolymeraseChainReaction）

Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数（Cyclethreshold）

CY5：花菁染料（Cyaninedye）

DNA：脱氧核糖核苷酸（Deoxyribonucleicacid)

FAM：6-羧基荧光素（6-carboxyfluorescein)

PCV1：猪圆环病毒1型（Porcinecircovirustype1）

PCV2：猪圆环病毒2型（Porcinecircovirustype2）

PCV3：猪圆环病毒3型（Porcinecircovirustype3）

VIC：绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein）

5试剂和耗材

5.1核酸提取试剂

1

选取商品化的病毒DNA提取试剂盒进行猪圆环病毒DNA提取。也可按照GB/T35901进行猪圆环病

毒DNA提取。

5.2荧光PCR扩增试剂

选取商品化的PCR扩增预混试剂。

5.3阴性对照和阳性对照

5.3.1阳性对照的制备按照附录A。

5.3.2阴性对照为无核酸酶水。

5.4引物探针

引物和探针名称序列按照附录B。

5.5其他试剂

无水乙醇、无核酸酶水、生理盐水。

6仪器与耗材

6.1多通道实时荧光PCR仪。

6.2电子天平。

6.3恒温水浴锅。

6.4高速冷冻离心机：离心速度可达12000r/min以上。

6.51.5mL灭菌离心管。

6.6组织研磨器。

6.7-20℃冰箱和4℃~8℃冰箱。

6.8涡旋振荡仪。

6.9手动单道移液器（1μL-10μL、5μL-50μL、20μL-200μL）。

6.10高压灭菌器。

7实验前准备

7.1样品的采集

猪血液、肺、扁桃体或脑等病灶组织及环境样品的采集按照NY/T541相关条款执行。

7.2样品的保存及运输

采集或处理好的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；如需长期保存，应置于-80℃保存，避

免反复冻融（冻融不超过3次），样品采用低温保存运输。

2

7.3样品的处理

7.3.1全血和环境样品

血液或环境样品混匀后，转入1.5mL灭菌离心管中，直接用于核酸提取或4℃保存备用。

7.3.2猪肺、扁桃体或脑等病灶组织样品

将采集的肺、扁桃体或脑等病灶组织及环境样品，称取样品约1g，用手术剪剪碎混匀后取0.05g于

研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5mL无菌离心管中，8000r/min离心2min，

取上清液200µl备用。

8操作步骤

8.1病毒基因组提取

按照所选取的病毒DNA提取试剂盒说明书进行猪圆环病毒DNA提取。

8.2实时荧光PCR扩增方法

配制猪圆环病毒1型、2型、3型三重实时荧光PCR扩增反应体系，见表1。

表1扩增反应体系

试剂