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质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳

一、前言

质粒

质粒是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够

自主复制的较小的DNA分子(即细胞附殖粒、又胞附殖粒)。大部分

的质粒虽然都是环状构型,它存在于许多细菌以及酵母菌等生物(多

为原核生物)中,乃至于植物的线粒体等胞器中。然而,1984年,

在Streptomycescoelicoler(天蓝色链霉菌)等放线菌以及在

Borreliahermsii(赫氏蜱疏螺旋体)等原核生物中,又相继发现线形质

粒。

天然质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。质粒

天然存在于这生物里面,有时候一个细胞里面可以同时有一种乃至

于数种的质粒同时存在。质粒的套数在细胞里从单一到数千都有可

能。有时有质粒含有某种抗药基因(如大肠杆菌中就有含有抗四环

素基因的质粒)。有一质粒携带的基因则可以赋予细胞额外的生理

代谢能力,乃至于在一细菌中提高它的致病力。一般来说,质粒的

存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。它是基因工程最常见的

运载体。

质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型和松弛控制

型。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它

也不能复制,通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子,如F因子。

后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷

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贝,一般在20个以上,如ColE1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-

氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到

抑制,紧密型质粒复制停止,而松弛型质粒继续复制,质粒拷贝数可

由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的

含量可由原来的2%增加至40-50%。

把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细

胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体。细菌质粒是重组DNA技术中

常用的载体。质粒分子本身是含有复制功能的遗传结构。质粒还带有

某遗传信息,所以会赋予宿主细胞一遗传性状。其自我复制能力

及所携带的遗传信息在重组DNA操作,如扩增、筛选过程中都是极

为有用的。

质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工

构建的。与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择

性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性

内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部分非必需序列,使

分子量尽可能减少,以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一多

用途的辅助序列,这用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克

隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴

定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大

致应有下列一特性:⑴分子量小、多拷贝、松弛控制型;⑵具有多种

常用的限制性内切酶的单切点;⑶能插入较大的外源DNA片段;⑷具

有两个以上的遗传标记物,便于鉴定和筛选。⑸对宿主细胞无害。常

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用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间,如PBR322、PUC系

列、PGEM系列和pBlescript(简称pBS)等。

质粒的不兼容性

利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,

当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的

过程中彼此竞争,在一细胞中,一种质粒占优势,而在另一细胞

中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,

因而在细胞后代中只有两种质粒的一种,这种现象称

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