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多发性骨髓瘤应用二代测序
监测微小残留病
一、背景
多发性骨髓瘤(multiplemyeloma,MM)是一种细胞遗传学高度异质的克隆性浆细胞增殖性肿瘤,是血液系统的常见肿瘤。近几年多种新型作用机制靶向药物的上市大大提高了MM患者治疗的缓解深度并延长了生存期。但由于大部分患者体内存在微小残留病(minimalresidualdisease,MRD),最终仍会复发。
MRD可在低于传统形态学检测多个数量级下检测恶性肿瘤是否持续存在,是评估肿瘤负荷的常用指标,可反映患者对治疗的反应,也可作为评估患者未来复发风险的预后工具。
一、背景
二代测序(next-generationsequencing,NGS)作为新的分子生物学技术,具有通量高、灵敏度高、成本低等优势,已成为MM患者MRD评估的主要研究方法之一。
目前应用NGS监测MM患者MRD,主要检测的目标基因是IG基因克隆性重排。需要先确定初诊MM患者全骨髓细胞中肿瘤浆细胞IG克隆性重排,包括IGH和(或)IGK基因克隆性重排的类型和序列。在患者后续的随访标本中,以诊断时检测到的克隆性重排序列作为分子标志进行MRD监测。
二、实验流程
1.样本采集:
MM患者建议采集新鲜骨髓标本进行NGS检测,不推荐使用外周血。如因某些原因不能采集到新鲜标本,也可使用冻存标本,建议在-80℃及以下保存并尽快送检,防止DNA降解。对于初诊患者,骨髓采集量以1~3ml为宜。对于缓解患者,骨髓采集量以3~5ml为宜,若白细胞计数偏低,应适当调整采集量,使有核细胞总数达到1×107个以上。骨髓标本采集管要求EDTA或枸橼酸钠抗凝,禁止使用肝素抗凝。如外地运输标本,推荐72h内4℃冷藏运送并具备相应物流质控体系。
二、实验流程
2.核酸提取:
DNA质量是NGS检测是否成功的关键因素。样本处理可采用红细胞裂解液离心沉淀全部有核细胞。提取有核细胞中的核酸DNA,DNA提取方法可以使用过滤柱法、磁珠法等,推荐使用商品化的DNA抽提试剂盒。抽提完成的核酸必须评估其质量,评价指标包括DNA浓度、纯度和完整性。RNA、蛋白、无机盐、各种杂质的污染及DNA的降解程度均会影响最终检测结果的灵敏度。因此,实验室应设立明确的合格DNA样本的判断标准。DNA完整性评估可使用琼脂糖凝胶电泳、安捷伦基因组DNAScreenTape分析等。
二、实验流程
3.文库制备:
文库制备用于检测是否目标区域的富集,常用的方法有杂交捕获法和扩增子法。针对IG重排的特殊性,目前国内外普遍采用扩增子法建库,即设计一系列引物,多重PCR扩增目的区域片段。对于多样本同时检测可以加入不同的分子标签以区分多个不同的检测标本。可以使用商品化的NGS重排检测试剂盒。
二、实验流程
4.文库定量:
文库质量可直接影响最终测序数据的质量。如文库浓度过高可导致多克隆数据的产生,降低有效测序数据量;过低则可导致整体测序数据的减少,因此,在测序之前需要进行文库的定量。目前常用的方法有Qubit荧光计、实时荧光定量PCR等。
二、实验流程
5.上机测序:
目前国内实验室通常采用的NGS测序平台有三大类:Illumina、ThermoFisher、MGI,每个平台有不同型号的配置设备。测序检测前需根据测序平台确定相应的数据参数,并根据测序片段的长度、检测标本的数量、标本的质量和最低测序深度等因素选用合适的芯片,以保证本次测序结果数据质量合格,能够分析出最低检测下限阳性对照标本。
二、实验流程
5.上机测序:
目前国内实验室通常采用的NGS测序平台有三大类:Illumina、ThermoFisher、MGI,每个平台有不同型号的配置设备。测序检测前需根据测序平台确定相应的数据参数,并根据测序片段的长度、检测标本的数量、标本的质量和最低测序深度等因素选用合适的芯片,以保证本次测序结果数据质量合格,能够分析出最低检测下限阳性对照标本。
三、生物信息学分析流程
1.质控分析:
对下机数据进行质量评估,制定有效的质量控制标准,包括测序数据质量、测序覆盖度、阴性和阳性标本检测结果等评价参数。如S5或PGM测序平台质量标准包括装载量50%、富集率50%、克隆数50%;Miseq测序平台质量标准包括V2试剂PE250测序碱基的质量Q3075%、V3试剂PE300测序碱基的质量Q3070%。
三、生物信息学分析流程
2.数据过滤:
需要明确对测序数据的过滤标准,包括对测序质量低的序列、长度不完整的序列、每张芯片由于接头污染引起标本之间交叉污染等进行过滤。针对IG重排需要过滤掉缺少V区或J区的序列、无法组装成完整克隆类型的序列。
三、生物信息学分析流程
3.序列比对:
IG重排比对不同于常规NGS使用的人类基因组参考序列,需要使用专门的基因重排参考序列库。推荐使用NC
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