磷酸铝与IL-18作新城疫基因疫苗佐剂的探讨.doc

磷酸铝与IL-18作新城疫基因疫苗佐剂的探讨

[摘要]本研究的目的是探讨传统佐剂磷酸铝与新型免疫佐剂分子IL－18联合应用，提高新城疫F基因疫苗免疫效果及其条件和机理。

研究方法在原有已构建好的真核表达质粒pcDNA-F和鸡白介素18基因真核表达质粒pcDNAcIL-18的基础上，大量提取质粒pcDNAcIL-18和pcDNA-F，并进行含量测定，加入适量佐剂磷酸铝；分组免疫鸡群，设立注射传统疫苗和仅注射生理盐水对照。各组免疫后以HI试验定期监测血液的NDV抗体水平并进行近期攻毒保护试验。

试验结果表明：使用磷酸铝佐剂和IL-18联合与新城疫F基因疫苗经2次免疫的鸡群近期攻毒保护率比单用F基因疫苗的222％提高到了727％，虽然仍比不上传统疫苗弱毒疫苗C30一次免疫889％，C30一免＋灭活疫苗二免100％的保护效果，但为NDVF基因疫苗的进一步开发应用研究展现了前景，增强了信心。

[关键词]鸡新城疫F基因疫苗IL-18磷酸铝

新城疫是危害养鸡业的A类传染病。1990年美国已注册NDVF基因重组鸡痘病毒活载体苗VectorVAXFP-N[1]。我国尚未有自主产权的DNA疫苗。导师黄青云教授指导研究生已成功构建NDVF基因和鸡白细胞介素18（IL-18）基因真核表达载体pcDNA-F与pcDNAcIL-18，经鸡的初步免疫试验获得了相当的免疫效果，但有待提高[1][2]。本项目在已有免疫试验基础上，参考国内外必威体育精装版报告，选用实用的传统佐剂磷酸铝[3－8]，探讨其pcDNAcIL-18共同作NDVF基因疫苗佐剂，提高免疫效果的作用及其条件和机理。

1实验材料和仪器

11主要试验材料

pcDNA-F，pcDNA-cIL-18（导师提供）；磷酸铝胶；DL15000DNAmarker，lambdaDNAHindIIIMarker，DL2000DNAmarker（购自广州英韦创津生物科技有限公司）；PEG8000，LiCl，乙酸铵（购自广州精科有限公司）；EDTA，Tris-Cl，NaOH，SDS，乙酸钾，冰醋酸，异丙醇（购自广州梓兴有限公司）；NDV抗原，ND阳性血清ND阴性血清（购自肇庆大华农生物有限公司）；LB肉汤培养基（购自广州市微生物研究所）；

NDV标准强毒株F48E9（传染病实验室贺东升副教授提供）；

solutionⅠ：192g葡萄糖160mL双蒸水4mL05mol/LEDTA5mL1mol/LTris-Cl（pH80），加双蒸水定容至200mL，115℃20min灭菌，4℃保存；

solutionⅡ：02mol/LNaOH，1%（w/v）SDS，现配现用；

solutionⅢ：5mol/L乙酸钾60mL115mL冰醋酸285mL双蒸水；

实验用岭南黄鸡130只（购自广东智威畜牧水产有限公司）。

12主要试验仪器

电子天平（上海天平仪器厂）TGL-16C台式离心机（上海安亭科学仪器厂）TDL-5000B水平冰冻离心机（上海安亭科学仪器厂）TGL-18R冰冻高速离心机（珠海黑马医学仪器有限公司）恒温水浴振荡器（广州天河精科化波仪器批发部）JC303-4A电热培养箱（上海嘉程仪器设备厂）752紫外光册分光光度计（上海第三分析仪器厂）DK-8D型电热恒温水槽（上海森信实验仪器有限公司）HV30000多用电泳仪（北京东方仪器厂）组织匀浆机（Flucko）PCR仪（UNO-ⅡBiometra公司）琼脂糖凝胶电泳槽(北京科普仪器厂)紫外分析仪(上海四星生物技术有限公司)黑马凝胶图象分析仪(珠海黑马医学仪器有限公司)核酸与蛋白自动检测仪(Eppendorf)。

2方法

21重组质粒PcDNA-F和pcDNAcIL-18的鉴定

将含pcDNA-FpcDNAcIL-18的基因工程苗JM109cos7从－70℃冰箱取出，参照参考文献[1][2]介绍的方法，分别进行培养，提取重组质粒，作PCR和双酶切鉴定。

22pcDNA-F与pcDNAcIL-18质粒的大量制备及含量测量

参照《分子克隆实验指南》（J萨姆布鲁克，1992）的聚乙二醇沉淀法[9]，大量提取纯化载体，操作如下：

（1）分别将含有pcDNA-FpcDNAcIL-18质粒的JM109菌株按1％的浓度接种100mLLB液体培养基（Amp+）中，37℃150rpm振摇培养18～20h；

（2）将菌液离心沉淀，沉淀物重悬于3mLsolutionⅠ中，剧烈震荡混匀，随后加入6mL新鲜配制的solutionⅡ，旋紧管盖，缓慢颠倒离心管数次充分混匀，直至液体变透明凝胶状，冰浴10min；

（3）加入预冷的45mLsolutionⅢ，混匀，冰浴20min，可见产生大量白色沉淀；

（4）4℃7