大鼠肌肉卫星细胞分离-江志辉.docx

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大鼠肌肉卫星细胞分离

1.1?实验材料

清洁级SD大鼠（~30日龄）若干。胰蛋白酶、胶原酶I。培养条件：DMEM/F12+?20%FBS?+?2.5ng/mLbFGF+1%谷氨酰胺+1%双抗。

1.2大鼠肌肉卫星细胞分离步骤?

1.取腓肠肌：取1.1的老鼠，用75%乙醇消毒背部部皮肤，取双侧后肢后外侧切口，切开皮肤筋膜，完整切取双侧腓肠肌，迅速置于盛有D-PBS的培养皿中。

2.冲洗：分离出的组织用0.1MD-PBS冲洗数次，尽量漂白肌肉组织，洗去血细胞。

3.剔除多余组织：将组织挑出放置含D-PBS的培养皿中，尽可能剔除血管、神经、结缔组织。

4.剪碎：将肌组织块仔细剪碎，将组织碎块移入离心管中，反复吹打，静置，去除上清，取沉淀。

5.消化：取第4步的沉淀，加入胶原酶I（0.1%）置于37度恒温水浴锅消化分30分钟（每隔5min轻轻摇晃几次）。加入DMEM/F12完全培养液终止消化（体积比1：3），离心（1500rpm5min），去除上清。

6.再次消化：取第5步的沉淀，加入胰蛋白酶消化5-15min。加入完全培养液终止，用吸管轻轻吹打数次分散细胞，经100目筛网过滤。离心（1500rpm、5min），弃上清液，用适量的DMEM/F12培养液重悬。

7.纯化、培养：将细胞悬液铺于T25瓶中，差贴（总共3次/30min），将上清转移至另一T25瓶，放于恒温培养箱中培养4-7天。

8.贴壁后再次纯化：将上述贴壁细胞用胰酶消化（1-2min），离心，差贴1次（30min/次），然后将差贴后的细胞上清转移至新的瓶中培养。计数，取适量铺于24孔板中（5*104/孔），次日给出鉴定样本。

操作演示：

1.3结果：病理细胞鉴定分析（鉴定指标：细胞质Desmin和细胞核PAX7）

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