流式的使用方法.pptx

开拓进取继往开来;;;;;;RTCA(RealTimeCellularAnalysis)检测原理

基于微电子阻抗技术的细胞检测方法;A549(10000)

A549(5000)

A549(2500)

A549(1250)

A549(625)

A549(312)

A549(156)

A549(78)

;;;;;;1激光

2通道

;;流式常见问题：

1：完整的流式方案需要哪些对照

2：多色组合原则

3：样本制备

数据分析：

1：细胞周期

2：细胞凋亡

3：细胞增殖

4：免疫分型;对于处在流动状态中的细胞或颗粒各项特性进行检测;研究对象:单细胞悬液

可检测的样本种类多样：外周血、骨髓、细胞穿刺液、洗脱液、

实体组织、培养细胞、微生物、藻类等;流式细胞术提供的信息：

-相对细胞大小（FSC-前向角散射光）

-相对细胞颗粒密度和内部复杂度(SSC-侧向角散色光)

-染色过细胞的相对荧光强度(荧光信号);;自发荧光：即不经荧光染色细胞内部荧光分子经光照发出的荧光。自发荧光信号为噪声信号。一般说来，细胞成分中能产生自发荧光的分子（核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强，如肿瘤细胞、粒细胞等；样本死细胞比例越高自发荧光越强。;

特异荧光：即抗体F(ab’)2段与细胞抗原特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光

非特异荧光：即抗体Fc段与细胞表面的Fc受体非特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光，使用FCR阻断剂与同型对照;;如何选择同型对照？

(1)一般选择与一抗的成分完全相同种属来源、相同亚型和亚链、相同荧光标记的抗体，比如抗人的CD56FITC标记的抗体，成份是MouseIgG1,kappa;。那么它的同型对照应该是FITC标记的MouseIgG1,kappa;。注意同型对照的成份跟它的名称是相同的.

(2)如果是抗体的组合形式是纯化的一抗＋荧光标记的二抗，那么应该选择一抗的同型对照。比如CD86的纯化抗体，成分是MouseIgG1,kappa;。它的同型对照是纯化的MouseIgG1,kappa;。它的二抗PE标记的抗小鼠IgG1,。那么染色方式如下：样本管：纯化的CD86＋PE标记的抗MouseIgG1(二抗)＋样本,同型对照管：纯化的同型对照＋PE标记的抗MouseIgG1(二抗)＋样本.

(3)如果没有找到适合的同型对照，在保持来源相同、荧光标记相同、免疫??蛋白类别相同条件下，那么优先选择的顺序应该是亚链不同－－亚型不同－－相同类别。比如，某种的抗体的来源是MouseIgG2а,kappa;。如果在同型对照表里面找到不到完全相同的同型对照，那么优先选择相同荧光标记MouseIgG2а为同型对照。如果也没有找到MouseIgG2а，那么优先选择相同荧光标记的MouseIgG2b作为同型对照。如果最后还是没有找到MouseIgG2b，那么选者相同荧光标记的MouseIgG2作为同型对照。;荧光补偿：;荧光补偿：

所谓“补偿”就是除去某一荧光素误入到其它荧光通道中的发射光信号。通过调节仪器完成这一步骤。往往我们通过检测带有单一荧光素的样本来减除误入其他荧光通道的信号，即单阳管。;完整的流式实验方案包括：

空白对照管：去除自发荧光

同型对照管：去除非特异性荧光

单阳补偿管：去除荧光泄漏

实验样本管：检测样本

……

;多色组合原则：;第一大点：按照仪器配置;激光器的功率、PMT电压、光学滤片、抗体克隆、生物样品和染色方法均会影响荧光素/试剂在某个特定仪器上的效果

;三大类:

Primary:很好鉴定，容易区分阴阳性细胞群，阴阳性峰分得很开Examples:CD3,CD4,CD45

Secondary:很好鉴定，较高水平表达，经常连续性表达Examples:CD27,CD28,CD45RA,CD45RO

Tertiary:低水平表达，激活性marker，或者表达区分不明显Example:CD25;高表达的可用不太亮的染料，低/弱表达的用亮的染料

抗原密度一定是在细胞亚群水平上确定的

这个规则会由于通道间相互溢漏，共表达等原因有所改变

抗原密度也会由于激活状态而有所改变

;第一小点—荧光染料光谱重叠最小化;1）避免使用补偿大的荧光染料;2）采用多激光激发减少重叠;第二小点—避免同一细胞使用偶联染料;由于tandem-dye降解会产生假阳性;避免染料和其衍生物（tandem-dye）在同一细胞上标记，或者选用更稳定的tandem-dye;多色组合原则：;NatRevImm