SD大鼠精原细胞的分离-江志辉.docx

SD大鼠精原细胞的分离

细胞分离：

试剂：D-Hanks（不含钙镁,不含酚红，Solarbio|货号：H1045）或者D-PBS不含钙镁,不含酚红，Solarbio|货号：D1040）；胶原酶Ⅱ（Solarbio|货号：C8150）；胶原酶Ⅳ（Solarbio|货号：C8160）；L-谷氨酰胺(200mM)（Solarbio|货号：G0200）；青链霉素混合液(100×)细胞培养专用p.s（Solarbio|货号：P1400）；FBS（CertificateofAnalysisGIBCOCatNo:10099）;DMEM/F-12,GlutaMAX?supplement（Gibco?货号；SD大鼠（10日龄，动物房提供）；

二、方法：

位置：

要的是图中黄褐色（实际组织是白色趋近透明的）的曲精管，其他的组织尽量去除。

要的是图中黄褐色（实际组织是白色趋近透明的）的曲精管，其他的组织尽量去除。

1.

2.吹打后，加入3-5倍的凯基DMEM/F12完全培养基终止消化，吹打1-2min，过100um细胞筛，1500rpm3-5min；铺板，静置培养3h后收集悬浮的精原细胞继续培养；

3.培养基：DMEM/F12+20%FBS+1%P.S+1%谷氨酰胺

三、鉴定结果：

从a图来看细胞得率高，b图来看90%以上的细胞c-kit胞浆阳性表达；

a:白光照片b:c-kitIF鉴定

四、小结：

i:消化用的胶原酶也可以是Ⅱ型胶原酶，但是优先选择Ⅳ型胶原酶（因为Ⅳ型胶原酶更不易使组织或者细胞受损），

ii:消化时间可以是：5-15min,因为曲精管柔软易消化,所以需要每5min观察一下消化的程度；

iii:以上鉴定结果可看出，此分离方法可以，不过若要进一步纯化，则可以参照以下方法；

iiii:若是鉴定：可以进一步纯化后鉴定，若是直接做实验，以上方法就可以达到实验要求；

iiiii:此细胞容易分化，分离后尽早做实验；

细胞纯化：

试剂：Percoll细胞分离液（Solarbio|货号：P8370）；

方法：

注：Ⅱ带：28%-36%之间的细胞；

鉴定：

从c图来看细胞得率不高，d图来看95%以上的细胞c-kit胞浆阳性表达；

c:白光照片d:c-kitIF鉴定

参考：王琳.大鼠精原细胞分离纯化及双酚A对其活力和结构的影响[D].新疆医科大学,2004.