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实验三高效苯酚降解菌的筛选及其性能测定

一、实验目的

1、掌握微生物分离纯化的基本操作；

2、掌握用选择性培养基从环境中分离苯酚降解菌的原理和方法；

3、掌握微生物对酚降解能力的测定方法；

4、掌握4-氨基安替比林法测定苯酚含量的方法。

二、实验原理

在工业废水的生物处理中，对污染成分单一的有毒废水，可以选育特定的高

效菌株进行处理。这些高效菌株以有机污染物作为其生长所需的能源、碳源或氮

源，从而使有机污染物得以降解，具有处理效率高、耐受毒性强等优点。

苯酚是一种在自然条件下难降解的有机物，其长期残留于空气、水体、土壤

中，会造成严重的环境污染，对人体、动物有较高毒性。本实验通过筛选苯酚降

解菌来处理含酚废水，将苯酚降解为为二氧化碳和水，消除对环境的污染。

+COOHCHCHCOOHCHCOOH

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CO+HO

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从环境中采样后，在以苯酚为唯一碳源的培养基中，经富集培养、分离纯化、

降解实验和性能测定，可筛选出高效酚降解菌。

三、实验器材与试剂

1、样品

实验土样采自校园污水处理厂。

2、器材

恒温培养箱、恒温摇床、分光光度计、比色皿、试管、250mL三角瓶、100mL

容量瓶、培养皿、涂布玻棒、量筒、天平、灭菌锅、酒精灯、接种环、棉花、棉

线、牛皮纸、pH试纸。

3、试剂

葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、苯酚、四硼酸钠（NaBO）、4-氨基安替比林、

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过硫酸铵（（NH4）SO）、KHPO、KHPO、MgSO、琼脂。

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苯酚标准溶液：称取分析纯苯酚1.0g，溶于蒸馏水中，稀释至1000mL，摇

匀。此溶液溶度为1000mg/L。测定标准曲线时将苯酚浓度稀释至100mg/L。

NaBO饱和溶液：称取NaBO40g，溶于1L蒸馏水中，冷却后使用，此

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溶液的pH值为10.1。

3%4-氨基安替比林溶液：称取分析纯4-氨基安替比林3g，溶于蒸馏水中，

并稀释至100mL，置于棕色瓶中，冰箱保存，可用两周。

2%（NH4）SO溶液：称取分析出（NH4）SO2g，溶于蒸馏水中，并稀

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释至100mL，置于棕色瓶中，冰箱保存，可用两周。

4、培养基

富集培养基：蛋白胨0.5g，KHPO0.1g，MgSO0.05g，水1000mL，调节pH

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7.2-7.4，高压蒸汽灭菌，冷却后视需要添加适量的苯酚。

基础培养基：KHPO0.6g，KHPO0.4g，NHNO0.5g，MgSO0.2g，CaCl0.025g，

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水1000mL，调节pH7.0-7.5，高压蒸汽灭菌，冷却后视需要添加适量的苯酚。

四、实验步骤

（一）富集培养和驯化

采集活性污泥或土样，接种于装有100mL富集培养基和玻璃珠并加有适量

苯酚（50mg/L）的三角瓶中，30℃振荡培养。待菌生长后，用无菌移液管吸取

1mL转至另一个装有100mL富集培养基和玻璃珠并加有适量苯酚的三角瓶中，

如此连续转接2-3次，每次所加的苯酚量适当增加，最后可得酚降解菌占绝对优

势的混合培养物。

（二）平板分离和纯化

1、用无菌移液管吸取经富集培养的混合液10mL，注入90m