水稻基因组DNA提取，PCR，纯化分子生物学实验报告.pdf

分子生物学实验报告

实验内容：设计一个完整的实验，以水稻基因

组为例，最终得到纯化的一个基因片段。

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水稻基因组DNA提取以及基因片段的扩增、纯化和检测

1.实验目的：

1.1熟练掌握实验室分子生物学相关的仪器的规范使用方法

1.2遵守实验室相关的实验规章制度，服从实验人员的管理

1.3熟练掌握实验室有关植物基因组DNA的简单提取方法以及检测方法

1.4了解琼脂糖凝胶电泳的原理，掌握胶体制备的方法以及电泳仪的操作方

法

1.5掌握PCR技术的操作流程，熟练使用PCR仪并了解其工作原理及检测方

法

1.6了解柱纯化的原理及使用方法

2.实验原理

1）水稻叶片基因组DNA提取

水稻属于真核生物，其DNA以双链线性高分子形式存在于细胞核中，一般

以染色质形式在。由于植物组细胞破裂之后，DNA酶会水解DNA因此在提取过

程总要加入EDTA螯合剂从而抑制DNA酶活性。

水稻叶片基因组DNA的提取主要是通过破碎组织和细胞从而通过对细胞内

其他杂质的去处来达到基因组DNA的提纯。提纯的产物通过1%的琼脂糖凝胶电

泳进行检验。

本实验是通过CTAB法来进行提取的，它是一种阳离子表面活性剂，能溶解

细胞膜和和核膜蛋白，使核蛋白解聚从而使DNA游离出来，已达到分离的目的。

2）特定基因片段的PCR扩增

PCR(PolymeraseChainReaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或

RNA的方法。它包括三个基本步骤:(1)变性(Denature):目的双链DNA片段在95℃

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下解链;(2)退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(55℃左右)下与模板上的

目的序列通过氢键配对;(3)延伸(Extension):在TaqDNA聚合酶合成DNA的最适

温度下,以目的DNA为模板进行合成.由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每

一轮循环将使目的DNA扩增一倍,这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环

的模板,所以经30轮循环就可使DNA扩增上百倍。

3）PCR产物的纯化

PCR产物的纯化在本实验中是通过柱纯化的方法进行的。试剂盒吸附柱中的

硅胶膜可以再高盐度的缓冲液下结合DNA，在通过低盐度的缓冲液洗脱，通过这

样的纯化过程去除了除特定产物外的其他DNA样品以及各种杂质。

4）DNA的琼脂糖凝胶电泳检测

琼脂糖凝胶电泳是利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应来达到

混合物分离的目的。DNA分子的迁移速率与其相对分子质量成反比，此外不同构

型的DNA分子的迁移速率不同（cccDNAｌDNAocDNA)。通过EB染色即可在紫

外灯下观察到胶体中DNA的纯度、大小等情况。

3.实验试剂和实验仪器

1）实验试剂

CTAB提取液、苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1)、氯仿/异戊醇(24:1)、EDTA、异

丙醇、70%乙醇；Taq酶、PCRBuffer、引物、dNTP、ddH2O；PB、PW、EB（Elution

Buffer）；西班牙琼脂糖、TAE、EB（溴化乙锭）溴酚黄、Marker。

2）实验仪器

移液器一套、离心管架、电子天平、水浴锅、微波炉、高速离心机、电泳系

列设备、研钵、紫外透射仪、PCR仪、漩涡振荡器、掌上离心机、

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3）实验耗材

配套的不同规格枪头、不同规格离心管、吸附柱、乳胶手套、PE手套以及

鞋套。

4.实验步骤

1）水稻叶片基因组DNA提取及检测

a.加1mlCTAB研磨0.2g水稻叶片，时间不超过5分钟，并迅速转移300ul

至2ml离心管中，再加300ulCTAB混匀后放入65度恒温水浴锅中水浴30分钟，

每个5分钟混匀一次。

b.向冷却后的离心管中加入等体积的