常用染色方法课件.pptVIP

常用的染色方法王萍

主要内容v瑞氏染色法v网织红细胞染色方法v革兰染色法v抗酸染色法2

瑞氏染色法v一、概述：瑞氏染色法是目前最常用的血涂片染色方法。其染料由酸性伊红和碱性美蓝组成，美蓝和伊红的水溶液混合后，产生一种不溶于水的伊红化美蓝中性沉淀（ME），即瑞氏染料。将适量的ME溶解于甲醇中，即成为瑞氏染液。3

瑞氏染色法v二、细胞着色原理：既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用。各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。如血红蛋白、嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞胞质为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色或蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫红色，称为嗜中性物质、原始红细胞、早幼红细胞胞质、核仁含较多酸性物质，染成较浓厚的蓝色；中幼红细胞既含酸性物质，又含碱性物质，染成红蓝色或灰红色；完全成熟红细胞，酸性物质彻底消失后，染成粉红色。4

瑞氏染色法v三、操作：1.制作血液或脱落细胞涂片，自然干燥固定；2.用蜡笔在血膜两头划线，滴加瑞氏染液3～5滴以覆盖整个血膜，固定1～2分钟；滴加等量或稍多的缓冲液（未加缓冲液涂片上有染料颗粒残留），吸球吹匀或摇动玻片染色5～10分钟；3.用流动水从玻片的一侧冲去染液，自然干燥（或滤纸吸干）；4.镜检。5

瑞氏染色法v四、注意事项：1、PH对细胞染色有影响。由于细胞中各种蛋白质均为两性电解质，所带电荷随溶液PH值而定。在酸性环境中正电荷增多，已与酸性伊红结合，染色偏红；相反，则易与美蓝结合，染色偏蓝。因此，应使用清洁中性的载玻片，稀释染液必须用PH6.8缓冲液。冲洗玻片必须用流水。2、染色的时间与染液浓度、染色时温度成反比；而与细胞数量成正比。3、冲洗时不能先倒掉染液，应用流水冲去，以防染料沉淀在血膜上。4、如血膜上有染料颗粒沉积，可加少许甲醇溶解，但需立即用水冲掉甲醇，以免脱色。6

瑞氏染色法5、染色过淡，可以复染。复染时应先加缓冲液，创造良好的染色环境，而后加染液，或加染液与缓冲液的混合液，不可先加染液。6、染色过深可用水冲洗或浸泡水中一定时间，也可用甲醇脱色。7、染色偏酸或偏碱时，均应更换缓冲液再重染。8、瑞氏染液的质量好坏除了用血涂片实际染色效果评价外，还可采用吸光度比值RA评价。瑞氏染液的成熟指数以RA（A/A）=1.3±0.1为宜。650nm525nm7

中性分叶核粒细胞嗜酸性粒细胞中性杆状核粒细胞淋巴细胞嗜碱性粒细胞8单核细胞

网织红细胞染色方法v一、概述：根据网织红细胞的形态特征和成熟程度将其分为五型：花冠型、丝球型、网型、破网型、点粒型。网织红细胞经体外活体染色后，显微镜下凡含有两个以上的深染颗粒或具有线网状结构的无核红细胞，即为网织红细胞。WHO推荐使用新亚甲蓝染色液，因其对网织红细胞染色力强且稳定而被首推。9

网织红细胞染色方法v二、操作：1、取小试管一支，加入新亚甲蓝染液2滴。2、加入末梢血或EDTA抗凝静脉血2滴于上述试管中，混匀。3、室温下放置15min后，取1滴制成薄片。4、油镜下至少计数1000个红细胞中网织红细胞数量。5、计算：网织红细胞百分数=计数1000个红细胞中的网织红细胞数/1000；网织红细胞绝对数（个/L）=网织红细胞百分数*红细胞数/L10

网织红细胞染色方法v三、注意事项：1、活体染色时间不能过短。室温低时，放37℃恒温箱。2、最好制两张片，每张计数1000个红细胞，避免分布不均引起的误差，涂片要薄而均匀，不使红细胞重叠。3、为计数方便，可于目镜中放一中间有孔硬纸片或用Miller窥盘，缩小视野便于计数。4、用瑞氏或瑞氏-吉姆萨染液复染后，可使网织红细胞计数结果减少。5、染液与血液比约为1：1，严重贫血时可适量增加血液的比例。11

Miller窥盘法v由于目测计数误差较大,用Miller窥盘法可减低标准误,特别是RBC较少时.v盘:厚1mm,直径19mm,圆玻片上划出格子:大方格内Ret/(小方格内RBCx9)X100%

网织红细胞13

革兰染色法v一、基本原理：革兰染色是细菌最基本的染色法，可用于标本涂片或菌落涂片。细菌的等电点较低，约在PH2-5，一般情况下细菌带负电荷，易于被带正电荷的碱性染料（结晶紫，碱性复红）着色。染色结果将细菌分为革兰阳性（紫色）和革兰阴性（红色）两类。14

革兰染色法v二、方法：涂片→干燥→固定→染色过程如下：1、涂片经火焰固定后，加结晶紫液染1min，清水冲去染液，倒去玻片上水。2、加碘液染1min，水洗。3、加脱色液（95%乙醇），不使摇动10-30s，至无紫色脱落为止，水洗。4、加复染液（碱性复红液），染30s，水洗。5、干后镜检。15

革兰染色法v三、注意事