蛋白质的提取与分离.pdfVIP

蛋白质提取与制备具体操作方法

1、原料的选择

早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经常遇到的多是

含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，因而对提取要求更复

杂一些。

原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成

本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量

来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属

的关系，如鲣的心肌细胞色素C较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查

制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解

蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属

必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但

使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对

动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。

2、前处理

a、细胞的破碎

材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷

冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先

将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难

易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即

可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。

⑴机械方法

主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达

10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两

个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间

隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。小量的

也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取，也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细。但在磨细时局

部往往生热导致变性或pH显著变化，尤其用玻璃粉和氧化铝时。磨细剂的吸附也可导致损

失。

⑵物理方法

主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。

Ⅰ反复冻融法

于冷藏库或干冰反复于零下15～20℃使之冻固，然后缓慢地融解，如此反复操作，使大部分细胞及细

胞内颗粒破坏。由于渗透压的变化，使结合水冻结产生组织的变性，冰片将细胞膜破碎，使蛋白质可

溶化，成为粘稠的浓溶液，但脂蛋白冻结变性。

Ⅱ冷热变替法

将材料投入沸水中，于90℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。

Ⅲ超声波法

暴露于9～10千周声波或10～500千周超声波所产生的机械振动，只要有设备该法方便且效果也好，

但一次处理量较小。应用超声波处理时应注意避免溶液中气泡的存在。处理一些超声波敏感的蛋白质

酶时宜慎重。

Ⅳ加压破碎法

加一定气压或水压也可使细胞破碎。

⑶化学及生物化学方法

Ⅰ有机溶媒法

粉碎后的新鲜材料在0℃以下加入5～10倍量的丙酮，迅速搅拌均匀，可破碎细胞膜，破坏蛋白质与脂

质的结合。蛋白质一般不变性，被脱脂和脱水成为干燥粉末。用少量乙醚洗，经滤纸干燥，如脱氢酶

等可保存数月不失去活性。

Ⅱ自溶法

将待破碎的鲜材料在一定pH和适当的温度下，利用自身的蛋白酶将细胞破坏，使细胞内含物释放出来。

比较稳定，变性较难，蛋白质不被分解而可溶化。利用该法可从胰脏制取羧肽酶。自体融解时需要时

间，需加少量甲苯、氯仿等。应防止细菌污染。于温室30℃左右较早溶化。自体融解过程中PH显著

变化，随时要调节pH。自溶温度选在0～4℃，因自溶时间较长，不易控制，所以制备活性蛋白质时较

少用。

Ⅲ酶法

与前述的自体融法同理，用胰蛋白酶等蛋白酶除去变性蛋白质。但值得提出的是溶菌酶处理时，它能

水解构成枯草菌等菌体膜的多糖类。能溶解菌的酶分布很广。尤其卵白中含量高，而多易结晶化。1g

菌体加1～10mg溶菌酶，pH6.2～7.01h内完全溶菌。于生理食盐水或0.2mol蔗糖溶液中溶菌，虽失去

细胞膜，但原形质没有脱出。除溶菌酶外，蜗牛酶及纤维素酶也常被选为破坏细菌及植物细胞用。

表面活性剂处理较常用的有十二烷基磺酸钠、氯化十二烷基吡淀及去氧胆酸钠等。此外一些细胞膜较

脆弱的细胞，可把它们置于水或低渗缓冲剂中透析将细胞胀破。

b、细胞器的分离

制备某一种生物大分子需要采用细胞中某一部分的材料，或者为了纯化某