基因的获取专题知识讲座.pptx

基因的获取专题知识讲座;化学合成法

PCR技术

筛选基因文库

转座子标签法

mRNA差异显示技术

生物信息技术分离和判定

酵母双杂交系统分离;（一）化学合成法单元操作;;亚磷酸三酯法合成过程;;;1、小片段粘接法：依据目标基因全序列，分别合成12-15碱基长单链DNA小片段;2、补丁延长法：依据目标基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长单链DNA小片段以及20-30碱基长单链DNA中片段;3、大片段酶促法：依据目标基因全序列，分别合成40-50碱基长单链DNA片段;（三）DNA化学合成用途;二、PCR技术取得目标基因;三、筛选基因文库(genelibrary);（一）基因文库容量和完备性;例：人单倍体DNA总长为2.9×109bp，基因文

库中克隆片段平均大小为15kb，则构建一个完备性为0.9基因文库最少需要45万个克隆；而当完备性提升到0.9999时，基因文库最少需要180万个克隆。;（二）理想基因文库条件;（三）基因组文库构建程序;（四）基因组文库构建程序;3、DNA片段和载体相连

直接连接、人工接头或同聚物加尾。;基因的获取专题知识讲座;（五）cDNA文库构建;cDNA文库

制备及筛选策略;1、总RNA提取;2、mRNA纯化;;（2）磁珠法纯化mRNA;PolyATtractmRNA分离纯化过程;3、cDNA合成;cDNA第二链合成;置换合成法：取得双链cDNA5’端也有几

对碱基缺失,但普通不影响编码区完整.;引导合成法：取得双链cDNA能保留完整5’端序列,但操作比较复杂，Poly（dC）/（dA），对重组子复制和测序不利。;4、双链cDNA克隆;（六）从基因组文库中筛选目标基因;四、转座子标签法取得目标基因;复制转座：在转座期间先复制一份拷贝，而

后拷贝转座到新位置，原位置仍保留原转座

因子。

非复制转座：直接从原来位置上转座插入新

位置，并留在插入位置上作用。;（１）Ac自主性因子：有自主剪接和转座功效

Ds非自主性因子：独立存在稳定，需要同一族自主性因子提供转座酶才有转座功效。;玉米花斑控制;（二）转座子标签法（transposontagging）;转座子标签法取得目标基因流程;五、图位克隆（mapbased