酶联免疫分析法.ppt

（2）氨基苯二酰肼类化合物鲁米诺（5-氨基-2,3-二氢-1,4-酞嗪二酮）、异鲁米诺（6-氨基-2,3-二氢-1,4-酞嗪二酮）及其衍生物如氨丁基乙基异鲁米诺（ABEI）、氨己基乙基异鲁米诺（AHEI）、氨丁基乙基鲁米诺（ABENH）等均属于这一类化学发光剂。鲁米诺类化合物的发光反应必须有催化剂（如过氧化物酶）催化，且与蛋白或肽结合后其发光作用减弱，因此鲁米诺类化合物在CLIA中是很好的底物，但已较少用于CLIA的标记。第63页,共85页，星期六，2024年，5月鲁米诺、异鲁米诺及其某些衍生物的结构式第64页,共85页，星期六，2024年，5月鲁米诺化学发光反应过程第65页,共85页，星期六，2024年，5月（3）咪唑类化合物咪唑类发光剂主要是咯吩碱。其反应过程首先是咯吩碱在碱性二甲亚砜水溶液中形成过氧化物中间体，再进行重排，降解，伴随产生化学发光，如图所示。第66页,共85页，星期六，2024年，5月咯吩碱的化学发光反应第67页,共85页，星期六，2024年，5月（4）苯酚类化合物用于化学发光免疫测定的酚类物质主要是邻苯三酚（焦性没食子酸），它是一种强还原剂，在催化剂（如HRP、血红素）催化下，与H2O2反应产生化学发光。第68页,共85页，星期六，2024年，5月（5）芳基草酸酯类化合物主要有双-（2,4,6-三氯苯基）草酸酯（TCPO）和双-（2,4-二硝基苯基）草酸酯（DNPO）。此类物质的发光反应是在反应体系中加入一种荧光染料如8-苯胺基-1-萘磺酸（ANS）作为荧光载体，通过过氧化草酸酯中间产物捕获化学能，使荧光体处于激发态，退激至基态时，放出光子。第69页,共85页，星期六，2024年，5月二、化学发光酶联免疫分析1、化学发光酶联免疫分析以在酶催化反应中可以产生化学发光的发光物质作为底物，以化学发光法检测酶的活性，则为化学发光酶联免疫分析（chemiluminescentenzymeimmuno-assay，CLEIA）。CLEIA方法的检测限低至10-17mol/L，达到或超过放射免疫分析的灵敏度。化学发光酶联免疫分析实际上是一种酶联免疫测定过程。第70页,共85页，星期六，2024年，5月2、CLEIA常用的标记酶CLEIA方法中最常用的是辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶（GOD）。此外还有丙酮酸激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、萤火虫素酶、碱性磷酸酶（AP）和β-D-半乳糖苷酶等。HRP标记的CLEIA，常用的底物为鲁米诺或其衍生物。第71页,共85页，星期六，2024年，5月鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，通常以0.1mol/L、pH8.6的Tris缓冲液作底物液，鲁米诺和H2O2在无HRP催化时也能缓慢自发发光，而在最后光强度测定中造成空白干扰，因而宜分别配制成两瓶试剂溶液，只在用前即刻混合。HRP催化鲁米诺的氧化反应可被某些酚类物质（如对碘苯酚）或萤火虫荧光素酶等增强。增强剂的作用是增强发光和延长发光时间，由此可提高敏感度。另外一些金属配合物能催化鲁米诺的化学发光反应。第72页,共85页，星期六，2024年，5月利用GOD对葡萄糖的催化氧化产生H2O2，用化学发光反应底物检测产生的H2O2，可间接测定GOD的活性。常见发光反应底物有鲁米诺、TCPO等。如Masako和Akio以GOD为标记酶，鲁米诺-H2O2作为发光底物，以流动注射化学发光分析测定17-α-羟基孕甾酮、甲胎蛋白和胰岛素，检测限分别为0.5pg/ml、0.1ng/ml和0.1ng/ml，而且分析速度快，测定结果精密度好。第73页,共85页，星期六，2024年，5月3、CLEIA常用的发光增强剂在反应体系中引入增强剂，可增强化学发光强度，提高化学发光测定的信噪比，提高化学发光酶联免疫分析灵敏度。最常用的增强剂有萤火虫荧光素、苯并噻唑、苯酚取代物、取代联苯胺、酸类衍生物、萘酚等。例如，萤火虫素、6-羟基苯噻唑衍生物等能加强HRP催化鲁米诺等的化学发光反应，使其强度提高80倍；某些酸类衍生物尤其是对碘酸、苯甲酸等的增强效果更佳，可使其发光强度提高1000倍，且延长发光持续时间。第74页,共85页，星期六，2024年，5月三、生物发光酶联免疫分析在1885～1887年，Dubois从发光昆虫和有双壳的软体动物体内提炼出各种材料，发现这些材料混合在一起