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用于高产l-乳酸的米根霉原生质体的制备与再生方法

专利名称：用于高产l-乳酸的米根霉原生质体的制备与再

生方法

技术领域：

本发明属于细胞工程中真菌原生质体制备与再生技术领域，

具体涉及米根霉原生质体制备与再生技术。

背景技术：

乳酸是一种重要的多用途有机酸，为三大有机酸之一，尤其

是L-乳酸，以其独特的构型优势，展示了广泛的应用前景。

L-乳酸广泛存在于植物与生物体内，在食品、医药、饲料、

化工等领域有重要的应用。近年来，随着聚乳酸的发展和应

用，L-乳酸的需求量越来越大。米根霉菌发酵营养要求低，

可直接利用淀粉无须糖化处理；耐低PH值，产物为高光学

纯度的L-乳酸，菌体大，容易分离，利于制得高品质产品

且节省发酵成本。但是，目前米根霉产L-乳酸方法仍然存

在发酵强度不高的缺点。主要原因是在利用米根霉发酵生产

L-乳酸的过程中，目标产物L-乳酸积累的抑制作用限制其

生产强度和浓度进一步提高。通过微生物育种选育高产L-

乳酸的米根霉菌株是进一步的研究方向。传统的菌株改良技

术是采用物理、化学或生物学诱变方法处理出发菌株，以随

机方式选育得到性能优异的变异菌株，其缺点是诱变剂所

诱发的遗传性状的改变是随机的，筛选正向突变的工作量较

大。原生质体技术，特别是原生质体融合，不仅可以在亲缘

关系较远的双亲间进行遗传物质的重组，还可以在种内进

行基因的重组，并且种内基因的重组更容易进行。将米根霉

通过不同方法诱变得到的耐酸突变株进行原生质体融合杂

交，得到可以缓解产物抑制的L-乳酸高产耐酸融合菌株。

原生质体制备和再生是进行融合的前提条件和关键技术。因

此，米根霉原生质体的制备与再生技术具有重要的理论与

实用价值。

发明内容

为了进行高产L-乳酸菌米根霉原生质体的制备及再生，本发

明提供一种操作简便、成本低的用于高产L-乳酸的米根霉

原生质体的制备与再生方法。本发明的具体操作步骤如下

用于高产L-乳酸的米根霉原生质体的制备与再生方法包括

下列操作步骤

A、制备米根霉孢子悬液

挑取米根霉AS3.8190%办0/7狀oryzaeAS3.819)菌丝一环，

接种在由50mL马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基制成的固体

斜面上，在温度32°C、培养72h，得到含有成熟米根霉孢

子的菌丝，加入30mL无菌蒸馏水洗孢子，得到含有孢子团

块的孢子液，将该孢子液振荡打碎孢子团块，过滤，取滤液

进行倍比稀释，显微镜下计数，得到成熟米根霉孢子浓度在

1XIO6个/mL的米根霉孢子悬液；

B、制备种子培养液

将2mL米根霉孢子悬液接种至20mL种子培养基中，控制摇

床转速200r/min，温度32°C培养18h，得到种子培养液；

所述种子培养基由下列重量配比的物质组成葡萄糖100g/L，

硫酸铵4g/L，磷酸二

3氢钾0.2g/L，硫酸镁0.25g/L，硫酸锌0.44g/L，硫酸

亚铁0.01g/L；

C、制备菌丝悬液

取5mL种子培养液，温度25°C、转速4000r/min、离心分

离10min，将菌丝与培养基分离；弃上清液，用4mL浓度

0.6mol/L的氯化钠溶液洗涤菌丝2次；弃上清液，用1mL

浓度6mol/L的氯化钠缓冲液重悬，得到菌丝悬液；

D、酶解细胞壁

取ImL菌丝悬液，加入ImL浓度1.5%的混合酶液，温度35°C

轻微振荡酶解2h；加入ImL渗透压稳定剂终止酶解反应，

得酶解溶液；

所述浓度1.5%混合酶液由下列重量配比的物质组成纤维素

酶15g/L、蜗牛酶15g/L、溶壁酶15g/L、溶剂为0.6mol

/L的氯化钠缓冲溶液，配置好后于4000r/min，离心15

min，收集上清液，用直径为0.45μm的超微微孔滤膜过滤

除菌；所述渗透压稳定剂为浓度0.6mol/L的氯化钠缓冲

液；

E、原生质体分离

过滤酶解溶液，滤去未被酶解的菌丝残片，滤液于温度

4°C、转速500r/min、离心分离15min；弃上清液，用1

2mL浓度0.6mol/L的氯化钠溶液洗涤1次，收集原生质体

重悬于ImL浓度0.6mol/L的氯化钠溶液中保存，得到原生

质体悬液；

F、原生质体再生

将原生质体悬液用浓度0.6mol/L的氯化钠溶液梯度稀释

100倍，取稀释液0.1mL分别涂布于马铃薯葡萄糖琼脂