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无缝克隆同源重组克隆
Gibsonassembly
简介(INTRODUCTION)
原理:Gibsonassembly是一种onestep,onepot的迅速基因组装方法。它只要要将基因片段和需要
的三种酶混淆在同一个管内在50°C下培育15-60min就能够获得组装好的DNA。
装置原理鉴于DNA片段间的重叠地区,过程依靠于三种酶:DNA外切酶(T5exonuclease),高保
真DNA聚合酶。(Phusionpolymerase)和耐热DNA连结(TaqDNAligase)的共同作用。首
先,T5核酸外切酶消化DNA片段的链方向是从5’到3’.每个DNA片段分别形成一个单链的突出部分,
因为着这两个相邻的突出片段有一部分拥有同源性能够互补,因此DNA片段退火,互补的序列从头配对连
结。而后,在空缺的部分DNA聚合酶以另一条DNA单链为模板,沿3方向将对应的脱氧核苷酸连结到单
链上,填充缺口。最后,连结酶将两条DNA单链黏合起来,密封裂痕。这样拥有重叠地区的DNA片段就
组装成一整条DNA分子了。下边是组装的表示图。
资料(MATERIALS)
试剂(REAGENTS)
NAD,H2O,1MMgCl2,1MDTT,10mMdNTPmix,1MTris-HClpH,50%PEG-8000,mg/
mLTagligase,μg/mLT5_ExO,Phusion(1×)、LB培育基、抗生素(据载体而定)、LB平板(相
应抗性)
实验前准备(SETUP)
于冰水浴中配制以下反响系统。假如不慎将液体粘在管壁,可通太短暂离心使其沉入管底。
4xisothermalassemblybuffer
NAD20mg
H2O300μL
1MMgCl2300μL
1MDTT300μL
10mMdNTPmix600μL
1MTris-HClpH3mL
无缝克隆同源重组克隆
50%PEG-80003mL
加水到mL,每管分500μL存于-20°C或-80°C冰箱,够3000个反响
2×assemblymix:bestcombination:
100reaction1mL
mg/mLTagligase10μL
μg/mLT5_ExO100μL
Phusion(1×)25μL
4×.buffer500μL
加水365μL,存于-20°C冰箱,有效期1年。
实验步骤(PROCEDURE)
设计引物经过PCR的方法在DNA片段的两头加上同源片段,NEB介绍同源片段的长度为15-40
bp,同时要求这部分对应的退火温度高于4°C。
1.进行DNA纯化:PCR产物进行琼脂糖电泳,胶回收。或许PCR产物回收试剂盒回收。
2.进行重组反响,以20μL反响系统为例:
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